1、中枢神经系统的基因治疗一.概述1. .基因治疗的概念:基因治疗是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因,或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。在基因治疗的早期，基因治疗是指将目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内基因组发生整合，成为宿主遗传物质的一部分，目的基因表达产物起到对疾病的治疗作用，随着基因治疗基础研究的发展，治疗研究的技术不断增加，不仅可以将外源性正常基因导入到病变细胞中，替代或与缺陷基因共存，产生正常基因表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质，而且可以采用适当的技术抑制细胞内过盛表达的基因，达到治疗疾病的目的。2.基因治疗研究的主要内容或策略：（一
2、）基因标记：基因标记（gene labeling)实验是基因治疗的前奏。标记假定对患者有治疗作用的细胞，用标记实验验证两个问题：（1）外源基因能否安全地转移到患者体内（2）从患者体内取出的细胞能否检测到转移基因的存在。接受标记实验的患者不一定直接获得治疗效果，其主要目的是得到进一步临床基因治疗有用的信息。 目前常用的基因标记方法是将 neo 基因的重组逆转录病毒载体在体外转染细胞，然后输入体内，可以很方便地跟踪这种标记细胞的命运。 （二）基因置换：所谓基因置换（gene replacement)是指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因 基因置
3、换的目的是纠正缺陷基因，将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。 基因置换的必要条件是：对导入的基因及其产物有详尽的了解外来基因能有效地导入靶细胞；导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留；导入基因能有适度水平的表达；基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害。 应用基因打靶技术，在基因置换的实验研究中已取得了一些进展。（三）基因添加：基因添加或称基因增补（geng augmentation)是通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。 基因添加有两种类型：一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因，使导入的正常基因整合到基因组中，而细胞内的
4、缺陷基因并未除去，通过导入的正常基因表达产物，从而补偿缺陷基因的功能；二是向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的；（四）基因干预：基因干预（geneinterference)是指采用特定的方式来抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。3.基因转移技术和靶细胞（1）基因治疗的方式：有两种。第一种是体内直接转移基因，称为体内法，这是最有前途的方式，也是各种基因转移技术集中攻关的方向。但目前仍存在转移和表达效率低等困难。现已在腹腔、静脉、肝、肌肉、气管、乳腺及脑等多种组织器官获得成功。第二种是细胞介导的基因治疗，称为回体法，即先将
5、合适的靶细胞在体外进行扩增，将外源基因导入细胞内使其能高效表达，然后再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使外源基因在体内表达，从而达到治疗目的。这是目前最常用的方式，所使用的靶细胞既有细胞株也有原代细胞。 无论采用何种方式，基因治疗都必须通过适当的基因转移（gene transfer)技术将外源基因转移至特定细胞内。（2）基因转移的生物学方法：逆转录病毒载体：逆转录病毒载体是基因治疗中最常用的载体。常用的逆转录病毒载体是从小鼠白血病（Mo-MLV)的前病毒（DNA）制备的。逆转录病毒载体要通过将外源性基因插入逆转录病毒载体后，所得到的是 DNA，必须将其转变成假病毒，才能高效感染靶细胞，用于
6、基因治疗，制备假病毒的过程是在包装细胞中完成的。 包装细胞：包装细胞（pakaging cell)系是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳动物细胞而制备成的一种特殊细胞系，这种细胞因携带与逆转录病毒基因组而能够大量产生病毒包转蛋白。 将逆转录病毒载体（DNA）导入包装细胞后，插入基因组。 逆转录病毒的特点：逆转录病毒载体转变成假病毒颗粒后，假病毒颗粒中所包含的RNA 与逆转录病毒基因组的结构相似，实际上只是以目的基因和标记基因取代了病毒的结构基因。感染靶细胞的过程与普通逆转录病毒一样。RNA 进入靶细胞后，通过逆转录过程转变成前病毒 DNA 并整合到宿主细胞的染色体
7、 DNA 上，从而使目的基因成为宿主细胞染色体 DNA 的一部分，靶细胞成为稳定表达目的基因的转化细胞腺病毒载体：腺病毒基因组为线性双链 DNA，长 36kb。腺病毒基因组是由非结构性早期基因（E1-E4)、编码结构蛋白（L1-L5，IVa2) 的晚期基因和 RNA 聚合酶转录子（VA）组成。每个早期基因有单独的启动子，晚期基因由单一主要晚期启动子控制 ,两端是含有顺式调控元件的短的反向末端重复系列（ITR),是病毒复制和包装所必须的系列。 腺病毒载体具有以下优点：1）宿主领域广，而人类是 Ad 的自然宿主；2) Ad 蛋白的表达不以宿主细胞增殖为必要条件， Ad 载体不仅可以感染分裂期细胞，
8、也可以感染非分裂期的细胞；3)可获得高病毒效价，其病毒滴度可达 109-1011CFU/ml,适宜于临床基因治疗；4)重组体非常稳定，未发现载体导入后重排；5)与人类恶性肿瘤无关联，腺病毒仅能引起人呼吸道轻微炎症，不会引起肿瘤；6)腺病毒疫苗开发研究表明，腺病毒疫苗长期应用，未见明显副作用，提示腺病毒载体有较高的安全性；7)Ad 载体没有包膜，不易被补体所灭活，可直接体内使用；8)Ad 经受体介导进入细胞，形成内吞小体失去外衣后，病毒 DNA 进入核内，以附加体形式存在，保持自身线性结构，不整合入染色体，非整合作用使其更安全。腺相关病毒载体单纯疱疹病毒载体（2）基因转录的非生物学方法 脂质体方
9、法 直接注射法 电穿孔法 受体介导的基因转移技术（3）基因转移的靶细胞 造血细胞 皮肤成纤维细胞 肝细胞 血管内皮细胞 淋巴细胞 肌肉细胞 肿瘤细胞4.CNS 系统疾病的基因治疗的新进展（1）概述：基因治疗对于神经系统疾患是一种有希望的药物传送机制。目前该技术对加强生长因子对脊髓融合，椎间盘再生和脊髓和脑损伤的康复治疗尤为有用。基因治疗使局部分泌高水平的生长因子成为可能，消除了因大多数肽类神经生长因子半衰期过短而使用缓慢释放生长因子的携带物或经体外持续泵入生长因子的麻烦。(2)基因治疗与脊髓损伤： 基因治疗脊髓损伤（）既不存在胎儿神经组织移植的组织来源问题，且比外周神经组织移植引起的排异性低，
10、是目前脊髓损伤治疗中最有前途的方法，基因治疗的基因方式有两种：一是将目的基因直接导入体内靶细胞令其表达；二是将基因在体外导入适当的细胞内，并筛选出高效表达的移植细胞作为转基因中介移植到体内靶组织，不论采用何种方式，将基因导入细胞又可用多种手段实现：如微注射、脂质体等物理或化学手段；利用缺陷病毒作为载体感染细胞的生物学手段，因为用生物学手段转基因的细胞移植方法空间定位明确，所以目前最常采用它作为基因治疗效果的研究，虽基因治疗目前仍停留在实验探索阶段，一些问题尚待解决，但随着基因治疗技术方法的不断提高，它的临床应用前景可以预见。（3）基因治疗与神经营养因子家族相结合治疗 CNS 疾病： 基因治疗是
11、当前生物医学发展较快的领域。其对中枢神经系统损伤，特别是 SCI 的作用尚在探讨阶段。近年来，许多学者通过应用转基因技术发现一些特殊蛋白，主要是神经营养素家族在干预脊髓损伤后的病理反应和促进其功能恢复方面有潜在的治疗作用。神经营养因子(NTF)：是一类由神经元、神经支配的靶组织及胶质细胞产生，具有促进中枢及周围神经系统细胞分化、生长和存活作用，目前已知有 20 余种。部分(主要是NGF、BDNF、CNTF 、NT-3 等)对受损脊髓有促进神经元纤维再生的作用。人们发现脊髓损伤后，NTF 及其受体表达增加，出现自我保护反应。 Tuszynski 等在成鼠 SCI 后，通过基因转移 NGF 的研究
12、证实，NGF 能诱导感觉和交感神经元纤维再生，使局部运动神经元纤维也出现出芽现象。多数学者认为NTF 对脊髓损伤的再生修复作用，可能是先与神经元细胞膜、胞质轴膜上的受体结合，继而调控神经细胞内相关的细胞因子及钙离子的重新分布，改善损伤区的微循环，使之适于损伤脊髓的恢复。除此之外，NGF 尚有减少超氧化自由基对脂质膜的损害，由促蛋白磷酸化的作用和调节受损脊髓前角运动神经元的 mRNA 转录功能，有助于脊髓的恢复。（4）转基因移植治疗 CNS 疾病的操作方法：为了向脊髓损伤区提供足够的、持久的神经营养因子，最佳的途径就是转基因。目前所应用的转基因技术，是以反转录病毒为载体，将外源性基因重组至病毒
13、DNA，然后再转染受体细胞，最后植入受损脊髓中，使之不断提供目的基因，发挥治疗作用。（5）CNS 疾病基因治疗的受体细胞：受体细胞：能够携带 NTF 基因的受体细胞有多种，主要有星形胶质细胞、肾上腺嗜铬细胞、成肌细胞、成纤维细胞和神经膜细胞等。目前用于 SCI 基因治疗研究的移植载体主要是成纤维细胞和神经膜细胞。成纤维细胞由于其获取途径简便，较易在体外繁殖的特性而得到广泛应用。由于神经膜细胞不仅可以作为 SCI 基因治疗的移植载体, 其本身即可促进中枢神经系统的再生、髓鞘的重建和部分神经功能的恢复，神经膜细胞在 SCl 基因治疗研究中的地位越来越受到重视。随着分子生物学的发展，通过转基因技术，
14、神经膜细胞的存活时间、分泌生长因子及引导轴突生长所需的细胞外基质等功能将有所提高。 目前对 SCI 实施基因治疗尚处于探索阶段。Tuszynski 等(1994)将 NGF 基因修饰成纤维细胞后，再植人无损伤鼠脊髓中(T7 平面)， 1 年后植入的成纤维细胞仍然存活，并促使大量的脊髓轴突生长(感觉纤维) 。同时将 NGF 基因修饰成纤维细胞植人半横贯伤鼠脊髓中(T7 平面)，1 年后植入的成纤维细胞仍能表达 NGF，并发现大量的脊髓轴突生长(感觉纤维 )。 Blesh 等(1997)采用 NGF、基因转移治疗慢性脊髓损伤，于半横断伤后 l3 个月始植入 NGF 基因修饰的成纤维细胞，移植后 3
15、5 个月发现脊髓背侧束的主要感觉轴突大量长人移植损伤区，而皮质脊髓束及局部运动轴突均无再生迹象。这一结果表明：在 SCI 慢性期，NGF 的局部持续表达也可促使特定脊髓轴突的再生。（6）基因治疗目前存在的问题和展望： 基因治疗在于转入调控再生的合适基因，目前对这方面的认识有限，使基因治疗的效果不佳。同时与所有的基因治疗一样存在免疫排斥反应、移植细胞不能长期存活及遗传修饰细胞转移基因的表达逐渐下降等问题，使基因治疗尚需进一步深入研究。虽然存在上述问题，并且目前关于 SCI 的基因治疗仍处于动物实验阶段，但基因治疗的临床应用前景仍十分诱人。随着分子生物学技术的发展，基因水平干预给中枢神经再生带来希望。今后可以把有丝分裂促进剂的基因插入成熟神经元的基因组，成熟神经元便有可能一改不能分裂的状态而变为能够自行繁殖并能再生修补损伤所造成的缺损，从而使脊髓组织像周周神经那样具有生长愈合的能力。相信随着 NTF 与神经系统疾病病因的关系的阐明，随着转基因技术的进步，应用 NTF 基因家族成员甚至其他基因治疗 SCI 必将成为现实.
