1、细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=KM式中L 为供试品的细菌内毒素限值，以 EUml、 EUmg 、EUU 表示。K 为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以 EU (kgh)表示。其中注射剂，K=5EU(kgh)；放射性药品注射剂，K=25EU
2、(kgh) ；鞘内用注射剂，K=0.2EU (kgh)。M 为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以 m1(kgh)、mg (kgh)、U(kg h)表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和临床用药须知等权威著作，中国人均体重按 60kg 计算，注射时间小于 l 小时的按 l 小时计。若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积计量乘以 0.027 即可转换为每千克体重计量即 M=(最大给药剂量/(m 2h)1.62m2)/60kg 。1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVDCL/L 为供试品的细菌内毒素限值；C 为供试品溶液的浓度
3、。当 L 以 EUml 表示时，C 等于 1.0mlm1；当 L 的单位以 EUmg 或 EUU 表示时，C 为供试品制备成溶液后的浓度，单位为 mgm1 或 Um1。作业指导书 指导书编号 TYFDC-SOP-FF-073第 2 页 共 18 页细菌内毒素检查法第二版 批准 李忠华 初审 吴雅凝 起草 吴雅凝在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则 MVD 取 1，可计算供试品的最小有效稀释浓度 C：L。1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。1.5 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验
4、标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则实验结果无效。2 实验材料及用具2.1 天平 供试品称量用，精度为 0.1mg 以下。2.2 电热干燥箱 除外源性内毒素用，温度应能达到 250。2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器(371)。2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在 l以下。2.5 旋涡混合器。2.6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。2.7 细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除
5、另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。2.8 凝胶法细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EUml（用于凝胶法）0.005EUml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用。2.9 实验用具 移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头） 、凝集管（10mm75mm） 、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75酒精棉、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经 250干烤至少 30min。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对实验无干扰的器械。2.10 细菌内毒素光度测定仪器。3 实验准备3.1 玻璃器皿的洗涤 将玻璃器
6、皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入电热干燥箱。3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至 250，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少 30min。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。3.3 供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或
7、在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的 pH 值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的 pH 值在在 6.08.0 的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节 pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在己去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。4 凝胶法操作方法4.1 鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。4.1.1 实验操作4.1.
8、1.1 细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合 15min。然后进行稀释，制备成 4 个浓度的细菌内毒素标准溶液，即 2、 、05、025( 为所复核的鲎试剂的标示灵敏度)，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合 30s（详细过程参见标准品使用说明书） 。若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装、保存。若为细菌内毒素工作品，为
9、一次性使用。4.1.1.2 待复核鲎试剂的准备取规格为 0.1ml支的鲎试剂 18 支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入 01ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是 01ml支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每 o1m1 分装到10mm75mm 凝集管中，要求至少分装 18 管备用。4.1.1.3 加样将已充分溶解的待复核鲎试剂 18 支（管）放在试管架上，排成 5 列，其中4 列 4 支（管） ，1 列 2 支（管） 。4
10、支（管）4 列每列每支分别加入 0.1ml 的2、 、0.5 和 0.25的内毒素标准溶液；另 2 支（管）加入 0.1ml 检查用水。4.1.1.4 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放人 371水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温602min。4.1.1.5 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转 180观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+) ；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(-) 。4.1.2 实验结果计算如最大浓度 2 4 管均为阳性，最低浓度 0.2
11、5 4 管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果( c)。clg -1(Xn)式中 X 为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。n 为每个浓度的平行管数。4.1.3 结果判断当 c 在 052（包括 0.5和 2）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以 （标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。4.1.4 举例设待复核鲎试剂的灵敏度为 0.125EUm1。实验结果如下：内毒素浓度（EU/ml） 0.25 0.125 0.0625 0.031 Nc
12、反应终点浓度1 + + - - - 0.1252 + - - - - 0.253 + + + - 0.0625重复管数 4 + + + - 0.0625c lg-1(X4) lg-1(lg0.125+lg0.25+lg0.0625+lg0.0625)4 0.105(EUm1)c 在 0.52 范围内，符合规定。并且使用该批鲎试剂时，其灵敏度为标示灵敏度 0.125EUml。4.2 干扰实验4.2.1 操作方法干扰实验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对
13、照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰实验预实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度(如 0.5 或 0.25EUm1)的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。4.2.1.1 干扰实验预实验预实验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度(当限值以 EUmg 或EUU 活性单位表示) 或最小不干扰稀释倍数 (当限值以 EUm1 表示)，为正式干扰实验提供依据。4.2.1.1.1 将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过
14、 MVDCL 0.03（003EU ml 为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度） 。4.2.1.1.2 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做 2 支供试品管和 2 支供试品阳性对照（即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成 2浓度） 。另取 2 支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2 支加入 2浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。供试品阳性对照制备举例：制备稀释倍数为 4 的供试品阳性对照液方法，取 0.3ml 浓度为 4EUml 的内毒素标准液+0.3ml 的稀释倍数为 2 的供试品稀释液一个制得 0.6ml 含 2EUm1 内毒素标准的稀释倍数为 4 的供试品稀释液。保温 60
15、2min 后，观察并记录结果。4.2.1.1.3 当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液 2 管为阴性，供试品阳性对照 2 管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大倍数稀释(不得超过 MVD=CL 0.03)，或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰几不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内
16、毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当供试品的内毒素限值单位为 EUmg 或 EUU 活性单位时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即该稀释倍数下溶液的浓度） ，以mgml 或活性单位m1 表示。4.2.1.1.4 举例例：设某注射液限值为 25EUml，按 MVDCL 计算出灵敏度为003EU m1 下的 MVD 为 83 倍，将供试品溶液稀释一系列检验，用灵敏度为025EU ml 的鲎试剂进行预实验。结果如下稀释倍数 原液 5 10 20 40 80供试品溶液 - - - - - - - - - - - -供试品阳性对照 - - - - - - + + +如上结果可初步确定该
17、样品的最小不干扰稀释倍数为 20 倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。4.2.1.2 干扰实验目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。4.2.1.2.1 制备内毒素标准对照溶液取 1 支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成 4 个浓度的标准溶液即 2、05、0 25， （方法同 4.1.1.1.1） 。4.2.1.2.2 制备含内毒素的供试品溶液4.2.1.2.2.1 将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将4.2.1.2.1 中的同支细菌内毒素标准品稀释成 4
18、 个浓度即 2、0.5 、0.25 的含内毒素的供试品溶液。以注射用头孢哌酮钠(1g瓶)为例：取 10ml 检查用水溶解注射用头孢哌酮钠即为 100mgml，设需将其稀释 20 倍(5mgm1)后备用。(注：冻干品或无菌粉末用检查用水溶解后体积有无变化，根据具体情况定)。取一支细菌内毒素标准品，加入 lml 检查用水溶解，然后取内毒素标准溶液0.3ml 制备内毒素标准对照溶液；再取内毒素标准溶液 0.3ml 加上 2.7ml 的5mgml 头孢哌酮钠溶液，即为含 10 倍内毒素稀释液的供试品溶液，取 0.3ml含 10 倍内毒素稀释液的供试品加上 2.7ml 的 5mgml 头孢哌酮钠溶液，即
19、为含100 倍内毒素稀释液的供试品溶液。其余依次类推。4.2.1.2.2.2 简化法制备含内毒素的供试品溶液：0.5ml 浓度为 1.0EUm1 的内毒素标准溶液+0.5ml 浓度为 10mgml 的供试品溶液得到 lml 的含 2内毒素的浓度为 5mgm1 的供试品溶液。同理分别用 0.5ml 浓度为 0.5EUml、0.25EUml 和 0125EUml 的内毒素标准溶液制备含 0.25EUml、0.125EUml 和 0.0625EUml 内毒素的浓度为 5mgml 的供试品系列溶液。 （其体积的大小视情况而定） 。4.2.1.2.3 鲎试剂的准备取规格为 0.1ml支的鲎试剂 28 支
20、，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是 0.1ml支时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每 0.1m1 分装到 1075mm 凝集管中，要求至少分装 36 管备用。4.2.1.2.4 加样将准备好的鲎试剂取其中 10 支（管）放在试管架上，排成 5 列，4 列 2 支（管） ，1 列 2 支（管） 。其中的 2 支 4 列每列每支分别加入 01ml 的20 、1.0、0.5、025 的内毒素标准溶液（C）
21、 ，另一列 2 支( 管)加入 0.1ml检查用水作为阴性对照（D） 。将另外 18 支（管）鲎试剂放在试管架上，排成 5 列，4 列 4 支(管)，1 列 2支(管)。其中的 4 支 4 列每列每支分别加入 0.1ml 的含20、1.0、05、0 25的内毒素的供试品溶液（B） ，另一列 2 支(管)加入0.1ml 供试品溶液作为样品阴性对照（A） 。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放人 371水浴或适宜恒温器中，保温 602min 后，观察并记录结果。4.2.2 实验结果计算只有当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C的结果符合
22、鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。4.2.3 结果判断当系列溶液 B 的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于 MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD 的进一步稀释，再重复干扰试验。应使用适宜方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除于扰，如对供试品进行更大倍数稀释，是排除干扰因素的简单有效方法。建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号(不包括亚批)的供试品，用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。4.2.4 举例设供试品为某注射液，预实验中初步确定
23、其最小不干扰稀释倍数为 20 倍，使用灵敏度为 0.125EUm1 的鲎试剂检测供试品是否对内毒素检查存在干扰。内毒素浓度（EU/ml） 0.25 0.125 0.0625 0.03 Nc 反应终点浓度+ + + - - 0.0625内毒素标准溶液+ + + - - 0.0625+ + - - - 0.125+ + - - - 0.125+ + - - 0.125含供试品的内毒素溶液+ + - - 0.125系列溶液 B 与 C 的结果均符合鲎试剂灵敏度复核试验要求，说明该供试品进行 20 倍稀释后确已排除干扰作用，在低于或等于此浓度的情况下即可使用细菌内毒素检查法。4.3 供试品细菌内毒素检
24、查凝胶限度试验在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做 2 支供试品管和 2 支供试品阳性对照，同时每次实验必须做 2 支阳性对照和 2 支阴性对照。4.3.1 操作方法4.3.1.1 供试品溶液的制备首先计算 MVDCL，C 、L 的意义同 1.3。 为所使用鲎试剂的标示灵敏度。然后将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过 MVD。4.3.1.2 阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成 2浓度的内毒素标准溶液。(方法同 4.1.1.1)。4.3.1.3 供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成 2浓度的内毒素溶液。 （方法同 42132 供试品阳性对照溶液
25、的制备） 。4.3.1.4 阴性对照液即细菌内毒素检查用水4.3.1.5 鲎试剂的准备取规格为 0.1ml支的鲎试剂 8 支，轻弹瓶壁使粉末落人瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内。每支加入01ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若使用的鲎试剂的规格不是 0.1ml支时，取若干支，按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每 0.1m1 分装到 1075mm 凝集管中，要求至少分装 8 管备用。4.3.1.6 加样 取 8 支（管）溶解好的鲎试剂，其中 2 支加入 0.1ml 供试品溶液或其稀释液（其稀
26、释倍数不得超过 MVD）作为供试品管，2 支加入 0.1ml 阳性对照溶液作为阳性对照管(PC)，2 支加入 01ml 检查用水作为阴性对照管(NC)，2 支加入 01ml 供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管(PPC)。4.3.1.7 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入 371水浴或适宜恒温器中，保温 602min。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。4.3.2 结果判断当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方为有效。若供试品 2 管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品 2管均为阳性，应认为不符合规定；如 2 管中 1 管为阳性
27、，1 管为阴性，按上述方法另取 4 支供试品管复试，4 管中如有 1 管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于 MVD 而结果出现 2 管均为阳性或 2 管中 1 管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至 MVD。若供试品的稀释倍数小于 MVD 而溶液 A 出现不符合规定时，需将供试品稀释至 MVD 重新实验，再对结果进行判断。4.3.3 举例供试品为葡萄糖注射液，其内毒素限值为 0.5EUml，设所用鲎试剂的灵敏度为 0.125EUml，MVDCL0501254将样品进行 4 倍稀释，并做 4 倍稀释下的供试品阳性对照。供试品 供试品阳性对照 阳性对照 阴性对照
28、- - + + + + - -结果是否有效 有效结果判断 该批葡萄糖注射液的内毒素含量小于 0.5EU/ml，符合规定4.4 凝胶半定量实验半定量实验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。系利用供试品系列与鲎试剂反应的终点浓度计算出供试品中内毒素的含量。4.4.1 操作方法4.4.1.1 供试品系列的制备用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成 2、4、8 等 n 个浓度，但最大稀释倍数不得超过 MVD。n 可根据实验设计不同确定。4.4.1.2 内毒素标准系列的制备用检查用水将内毒素标准品稀释成 4 个浓度的标准溶液即2、 1、05、025， （方法
29、同 4.1.1.1） 。4.4.1.3 供试品阳性对照溶液的制备用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将内毒素标准品制成 2浓度的内毒素溶液。 （方法同 4.2.1.1.2 供试品阳性对照溶液的制备） 。4.4.1.4 阴性对照液 即细菌内毒素检查用水。4.4.1.5 鲎试剂的准备取规格为 0.1ml支或分装好的鲎试剂 12+2n 支，其他准备按正式干扰实验项下的“鲎试剂准备” 。4.4.1.6 加样将准备好的鲎试剂取其中 10 支（管）放在试管架上，排成 5 列，每列 2 支。其中 4 列每列每支分别加入 0.1ml 的 2、 、0.5 、0.25 的内毒素标准溶液，另一列 2 支（管）加
30、入 0.1ml 检查用水作为阴性对照。将另外 2n 支（管）鲎试剂放在试管架上，排成 n 列，每列 2 支（管） 。每列每支分别加入 0.1ml 一个浓度的供试品溶液。另 2 支（管）加入 0.1ml 供试品阳性对照溶液作为供试品的阳性对照。4.4.1.7 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放人 371水浴或适宜恒温器中，保温 602min。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。4.4.2 实验结果计算如内毒素标准系列最大浓度 2均为阳性，最低浓度 0.25均为阴性，阴性对照为阴性供试品阳性对照为阳性时，按下式计算内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值( t)和供试品系
31、列溶液反应终点浓度的几何平均值(C E)。tlg -1(Xt2)CElg -1(XE2)式中 Xt 为内毒素溶液的反应终点浓度的对数值(1g)。XE 为供试品溶液的反应终点浓度的对数值(lg)。每个系列的反应终点浓度即每一系列平行管的终点稀释倍数 D 乘以宣试剂标示灵敏度 ，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度口。4.4.3 结果判断当 t 在 0.52 之间，试验方为有效。供试品的内毒素含量即为供试品系列反应终点浓度的几何平均值。系列溶液 A 中每一系列的终点稀释倍数乘以 ，为每个系列的反应终点浓度。如果检验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初
32、始稀释倍数，即得到每一系列内毒素浓度 c。若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试品符合规定。每一系列内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度按公式cE=antilg( /2)。如果试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒c素浓度小于 （如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于 乘以该供试品进行半定量试验的初始稀释倍数） 。若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时，则判定供试品不符合规定。当供试品溶液的所有平行管均为阳性，可记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以 。4.4.4 举例设供试品为某注射液，干扰实验已确定其最小不干扰稀释倍数为 20 倍，其内毒素限值为 10
33、EUml，现使用灵敏度为 003EUml 的鲎试剂检测供试品中的内毒素含量。MVDCL10003320 倍将供试品溶液先稀释至 20 倍后，再进行对倍稀释。将 20 倍稀释液稀释2、4、8、16 倍，同时制备内毒素标准系列。内毒素浓度(EUm1) 0.0625 0.03 0.015 0.0075 Nc 反应终点浓度+ - - - - 0.0625内毒素标准溶液+ - - - - 0.0625供试晶稀释倍数 1 2 4 8 16 PPC 反应终点稀释倍数+ + + + - + 8供试品系列+ + + - - + 4t1g -1(xt2)lg -1(lg00625+lg0，0625)200625(
34、EU m1)CElg -1(x2)lg -1lg(8003)+lg(4003)20170EUm1供试品 20 倍稀释液的内毒素含量0.170EUml由于供试品先被释释了 20 倍，因此供试品的内毒素含量为0.170203.40EUml，低于规定的内毒素限值，此批注射液内毒素检查项符合规定。5 光度测定法操作方法光度测定法分为浊度法和显色基质法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检
35、测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特殊底物显色释放出的有色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率到达某一预先设定的检测值度所需要的反应时间，或是检测值增长速度的方法。5.1 仪器的设置浊度法分为终点浊度法和动态浊度法，显色基质法也分为终点显色法和动态显色法。针对不同的方法，应配置相应的
36、测定仪器。在实验开始前，应根据仪器的说明和实验的设计设定反应时间，反应温度(一般为 371)，检测波长等相关系数。供试品和鲎试剂的分装加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，需参照所用仪器和试剂的有关说明进行。5.2 标准曲线的可靠性试验当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。5.2.1 实验操作5.2.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备用检查用水将一支内毒素标准品溶解稀释，并制成至少 3 个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于 10） ，如 10、l、0 1EU ml 或0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03EUm1
37、，但最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。稀释操作方法同凝胶法。5.2.1.2 鲎试剂的准备要求内毒素标准系列中每一浓度至少做 3 支平行管，并要求同时做 2 支阴性对照。根据所制备的标准曲线中浓度的个数来计算所需要的鲎试剂体积。由于凝胶法鲎试剂和光度测定法鲎试剂在工艺上有所不同，因此在进行光度法检测时需使用专用鲎试剂而不能用凝胶法鲎试剂代替。光度法鲎试剂都为0.5ml 以上装量，在溶解后需将所有鲎试剂混合在一起，备用。5.2.1.3 加样将标准内毒素溶液和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中，如小试管或微孔板。再加入要求体积的鲎试剂，轻轻混匀，避免产生气泡，然后将反应容器放人
38、光度测定仪中进行反应。5.2.2 结果判断当阴性对照的吸光度或透光率小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数()的绝对值应大于或等于 0.980，试验方为有效。否则须重新试验。5.3 干扰实验干扰实验的目的同凝胶法干扰实验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。5.3.1 实验操作5.3.1.1 标准曲线的制备操作同 5.2.1.1。5.3.1.2 将供试品进行一系列的稀释，但不得超过 MVD。选择标准曲线中点或一个靠近中点的一个内
39、毒素浓度，设为 m，作为添加到供试品中的标准内毒素浓度。可按如下方法制备供试品每一稀释倍数下的样品阳性对照：如使用的标准曲线为 50、5、0.5、0.05EUm1 的标准系列，选择0.5EU m1 浓度作为 m。现需制备稀释倍数为 4 的供试品阳性对照液。可取0.3ml 浓度为 1.0EUm1 的内毒素标准液+0.3ml 稀释倍数为 2 的供试品稀释液制得 06ml 含 0.5EUm1 内毒素标准的稀释倍数为 4 的供试品稀释液。也可按仪器或试剂厂商提供的其他方法配制。5.3.1.3 鲎试剂的准备根据标准曲线及供试品浓度个数来计算所需要的鲎试剂体积。鲎试剂溶解后需将所有试剂混合在一起，备用。
40、5.3.1.4 加样标准曲线每个浓度不少于 2 支平行管，供试品每个浓度不少于 2 支平行管，同时供试品每个浓度的样品阳性对照也不少于 2 支平行管。并用检查用水做 2支阴性对照。将标准内毒素溶液、供试品、供试品阳性对照和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中，再将鲎试剂也按要求的体积加入到反应容器中，轻轻混匀，避免产生气泡，然后将反应容器放入光度测定仪中进行反应。5.3.2 实验结果计算当反应完毕后，仪器自动生成标准曲线并按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量 Ct 和 Cs，按下式计算供试品每一浓度的回收率(R)。R(C s-Ct) m10
41、05.3.3 结果判断当供试品的内毒素的回收率在 50200之间时，则认为在此浓度下供试品溶液不存在干扰作用。当供试品系列的内毒素的回收率都不在指定的范围内，可重新制备最低浓度()更低的标准曲线（但不得超过时候鲎试剂的最低检测限） ，从而提高MVD，将供试品进行更大倍数的稀释来排除干扰。或按“凝胶法干扰试验”中提及的其他适宜方法去除干扰因素，并要重复干扰试验来验证处理的有效性。5.4 供试品细菌内毒素检查5.4.1 实验操作5.4.1.1 标准曲线的制备操作同 5.21.1。5.4.1.2 将供试品稀释至一个已证实无干扰作用的浓度，并同时制备该浓度下的供试品阳性对照。5.4.1.3 鲎试剂的准
42、备及加样标准曲线每个浓度不少于 2 支平行管，供试品不少于 2 支平行管，供试品阳性对照也不少于 2 支平行管。并用检查用水做 2 支阴性对照。将标准内毒素溶液、供试品、供试品阳性对照和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中，再将鲎试剂也按要求的体积加入到反应容器中，轻轻混匀，避免产生气泡，然后将反应容器放人光度测定仪中进行反应。5.4.2 结果判断当反应完毕后，使用标准曲线来计算供试品的每一个平行管的内毒素浓度。试验必须符合以下三个条件方为有效：(1)标准曲线的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求。(2)该浓度下的内毒素回收率要在 50200的范围内。(3)阴性对照的检测值
43、小于标准曲线最低点的检测值或反应时间应大于标准曲线最低点的反应时间。若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。6 注意事项6.1 实验前，须用肥皂洗手，用 75酒精棉球消毒。6.2 在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将洗耳球中的气体吹人溶液中，以防止气体中的内毒素进入供试液。6.3 溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。6.4 由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。6.5 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行。6.6 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计算和判断。6.7 实验操作应在清洁环境中进行，过程中应防止微生物的污染。本规范依据中国药典2015 年版四部通则 1143 细菌内毒素检查法制定。
