1、血小板聚集功能的检测及血小板聚集功能的检测及临床应用临床应用广东省人民医院广东省人民医院广东省医学科学院广东省医学科学院病理医学部检验科病理医学部检验科李广华李广华前言 血小板聚集功能的检测对于抗血小板药物的疗效监测，出血性疾病的鉴别和诊断以及对血栓性疾病的监测都具有重要的意义。 Born于 1962年首先应用比浊法检测血小板聚集功能，该技术是测定血小板聚集功能的经典方法 ，应用最为广泛 。 血小板的聚集是由各种诱导剂与血小板膜受体之间的相互作用而诱发的：这种相互作用通过膜的传递而激活血小板,使其膜表面另一个糖蛋白IIb/IIIa受体活化, 再与血浆中的纤维蛋白原结合, 介导血小板聚集。（三要
2、素：GPIIb-IIIa 和钙离子、纤维蛋白原） 目前认为有三条途径： 1.ADP途径，ADP、胶原、凝血酶、肾上腺素等均可诱导血小板释放内源性ADP。后者可引起血小板聚集。 2.TXA2途径：PGG2 、 PGH2及 TXA2可诱导血小板发生聚集反应，但不依赖ADP途径。 3.PAF途径：PAF 通过与血小板膜上的PAF 受体结合而发挥作用，引起血小板聚集。 目前血小板聚集功能的检测已经从传统的手工法发展到全自动仪器的检测 ,从单一的比浊法发展到阻抗法,剪切法,流式细胞术法、模拟体内初期止血（PFA-100）等等, 从单一的测定血小板聚集功能发展到能同时检测血小板释放ATP 和血小板内Ca2
3、+ 的含量，血小板释放颗粒及活化功能的测定，AA代谢产物测定，血小板内环腺苷酸( cAMP)和环鸟苷酸 ( cGMP)测定，血小板活化的新标志物等等。原理（比浊法） 将富血小板血浆(PRP) 置于比色管中,加入诱聚剂( 主要有ADP 、肾上腺素,胶原,凝血酶、花生四烯酸、TXA2,PAF 等 ),用一涂硅的小磁粒进行搅拌,血小板逐渐聚集,血浆浊度降低,透光度增加,记录此变化,形成血小板聚集的动态曲线,以 PRP的聚集率和透光度为 0%,乏血小板血浆(PPP) 所测得的聚集率和透光度为100%, 用血小板聚集仪进行自动测定、记录、描绘血小板聚集曲线。 不同诱导剂可产生不同类型的血小板聚集曲线：
4、ADP诱导血小板聚集在低浓度时(3ugmol/L)是不可逆性聚集。可使全部血小板对外源性ADP产生反应而立即得到1 个单一的聚集波； 适当浓度的肾上腺素亦可引双聚集波曲线,胶原引起的聚集曲线与ADP和肾上腺素不同, 不能直接聚集血小板,而是引起血小板内释放ADP等诱导聚集； 瑞斯托霉素与vWF 相互作用引起血小板GPIIb/IIIa受体激活而导致小板聚集。血小板聚集试验（阻抗法）原理可用全血或PRP 进行检测。检测杯中有一对铂电极，血小板在诱导剂的诱导下发生聚集时，可覆盖在铂电极表面，导致电阻抗的改变，后者的变化程度与聚集程度有关。此信号经过放大传送到监测器或计算机上进行处理，将电阻抗的改变转
5、换为聚集曲线从而计算出血小板的聚集率。阻抗法的优点 直接使用全血 全血中的其他血细胞同时存在，从而真正模拟了体内的生理环境 保存全部血小板，避免部分血小板因体积太大而在制备PRP 时丢失 对于脂血标本的检测，可以克服光学法检测时因过于浑浊而影响结果 全血电阻聚集仪与光学法相比，检测高凝状态时的血小板功能更为敏感阻抗法的不足之处 光学聚集仪耗时,对小聚集物的形成不敏感 ,，操作相对烦琐。 阻抗法与比浊法的结果无法换算。 尚缺乏大量应用的经验。血小板功能分析仪( PFA-100) 这是近年才出现的新仪器 ,目前 PFA-100系统是血细胞功能检测研究最多的方法之一。它在高切变率下 ,利用多种激活剂
6、进行血小板功能的测定 ,在检测血小板功能的临床工作中取得较多进展。血小板功能分析仪模拟体内初期止血 ,又名 “外出血时间测定 ”,检测与血小板黏附、 聚集、 栓子形成的初期止血障碍相关的疾病 ,也可监测抗血小板药物治疗。血小板功能分析仪( PFA-100) 优点：该方法操作简便易行、 重复性好 ,与光学血小板聚集仪法相关性较好 ,比出血时间等方法更为敏感。而且能检测血小板功能失调是原发性因素还是药物影响所致。 缺点：其对出血性疾病尚不能非常精确地预测 ,而且其结果也受很多因素影响 ,如血小板数量、 红血细胞压积、 血型及血浆中vWF水平等都会影响其结果。费用较高。血小板聚集功能检测（比浊法）
7、标本采集 1、抗凝剂：109mmol/L枸橼酸钠抗凝，BD 公司真空蓝头试管， 0.3mL抗凝剂+2.7mL 全血。 2、标本采集：空腹静脉穿刺，采集量为2 管。 3、注意事项：采集过程顺利，一针见血；避免反复穿刺而抽到组织液或气泡；迅速颠倒试管混匀全血3-4 次；标本运送过程保持室温，避免剧烈震荡。 4、对于红细胞压积：HCT55%时 V=0.00185V1 （ 1.00-）100 式中： V柠檬酸钠用量V1血量，ml 红细胞压积* HCT低, 抽血 3 ml ; HCT高, 抽血4 ml 标本制备 1、所有抗凝标本在室温下1000rpm 10 分钟或200 g 10分钟离心制备富含血小板血
8、浆（ PRP）。不要使用离心机刹车。用塑料移液管将 PRP转移至标有 PRP标签的塑料试管中（吸取时注意避免吸入红、白细胞，下同）。 PRP制取后在试验前应盖上盖子并在室温放置30分钟。 2、剩余标本在室温下3000rpm 10-15 分钟或1600-2000 g 10-15分钟离心制备贫血小板血浆（ PPP）。用塑料移液管将 PPP转移至标有 PPP标签的塑料试管并盖上盖子保持室温。 3、计数PRP 的血小板浓度。通过自体 PPP调节PRP使之血小板计数达到200 109/L。血小板计数低于100 109/L时可以造成异常结果。举例：PRP 为 300 109/L，反应体系 300L，血小板
9、数量应为200 109/L，根据C1V1=C2V2 ，则加入PRP 的体积 = 300L 200 109/L（ 300 109/L） =200L，加入 PPP的体积 = 300L-200L=100L。 注意事项 时间 应在采血后 3小时内完成。 温度 采血后标本应在 15-30C 的室温放置。切忌放入冰箱。 血浆的 pH 采血后血液中的 CO2不断逸出，使 pH上升。6.5-8.5的标本可获得最佳效果。所以一般在实验前半小时开盖为宜。 饮食 最好空腹，禁饮牛奶、豆浆和脂肪性食品。 诱导剂 ADP在保存中会分解，配制后最好分装，在 -20C以下的冰箱中保存。肾上腺素更容易分解，应以黑纸包裹避光。
10、 生物参考区间 各实验室应对试剂说明书提供的生物参考区间进行验证。 质量控制 室内质控：用已知正常人的混合 PRP标本建立典型的血小板聚集模式。这些模式的正常值用来同结果显著异常的标本进行比较就可以表明血小板机能障碍。最好每次试验前做一混合PRP 作为当日正常对照。血小板聚集试验的应用 三大功能: 一、抗血小板药物的监测 二、血小板功能异常的诊断 三、血栓性疾病的监测抗血小板药物的监测 血小板的作用 (1)血小板粘附功能 血小板可直接粘附于血管内皮下成分，如胶原及弹性蛋白等，亦可通过vWF及纤维连接蛋白等粘附蛋白介导而发生粘附。 (2)血小板聚集功能 血小板聚集是血小板参与止血和血栓形成的重要
11、环节，当血小板粘附于血管破损处或受到凝血酶、ADP等活化剂作用后即被活化，活化的血小板相互粘附在一起即为血小板聚集。血小板聚集与GPIIb- IIIa 、纤维蛋白原、钙离子有关。 (3)血小板的释放反应 血小板活化剂可以直接引起血小板释放反应并引起二相血小板聚集 (4)促凝作用 PF3可提供催化表面；完成因子X 和因子II 的活化。另外，血小板内容物中包含有种类较多的凝血因子，血小板活化释放时，因凝血因子的释放而加强局部的凝血作用。 (5)血块收缩功能 活化的血小板释放血块收缩蛋白，使血块收缩，有利于创口的缩小和愈合。 (6)维护血管内皮的完整性 血小板能填充受伤内皮细胞所造成的空隙，参与血管
12、内皮细胞的再生和修复过程，能增强血管壁的抗力，减低血管壁的通透性和脆性。鱼油，ASA非甾体抗炎药、TXA2合成酶抑制剂前列腺，NO，潘生丁GPIb/vWF拮抗剂GPIIb/IIIa拮抗剂内皮细胞血小板黏附血小板活化血小板释放血小板聚集切应力凝血酶-抗凝血酶5-HT-5HT拮抗剂ADP-波利维、抵克力得TXA2-TXA2受体拮抗剂抗血小板药物拮抗血小板活化的各阶段GP1b暴露的内皮下胶原花生四烯酸代谢花生四烯酸代谢TXA2ADP肾上腺素 Ca2+凝血酶内皮细胞cAMP前列环素无活性配体-受体GP IIb/IIIa受体(Fig 3)vWF抵克力得抵克力得氯吡格雷氯吡格雷TXA2TXA2ADP肾上腺
13、素5-羟色胺PDGF颗粒释放阿斯匹林阿斯匹林纤维蛋白原GP IIb/IIIa受体拮抗剂受体拮抗剂潘生丁潘生丁刺激抑制GP = glycoprotein; PDGF = platelet derived growth factor;vWF = von WillebrandfactorcAMP = cyclic adenosine monophosphateADP = adenosine diphosphateTXA2= thromboxane A2当今抗血小板药主体ASAP2Y12受体拮抗剂 GP b/ a拮抗剂抗血小板药物:血栓素A2 抑制剂阿司匹林，ASA 临床应用最早、最多的第一代抗血小板药物 ,其作用机制是使血小板的环氧酶 (PG合成酶)乙酰化,抑制血栓素A2(TXA2)的合成,还可使血小板膜蛋白乙酰化,并抑制血小板膜酶。国内外研究均表明,每天口服阿司匹林100mg,抑制血小板聚集作用最明显 ,且耐受性好、安全性高。血小板聚集被ASA抑制时的图形ADPADRAAColADPADRColAA10050血小板聚集率%246 810部分抑制24 6 10完全抑制时间（分）时间（分）
