1、1产品注册证号：国食药监械（进）字 2008 第 3400298 号 赛润 ELISA classic 弓形虫 IgM 抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）说明书德国维润赛润研发有限公司北京代表处北京建国门北大街 8 号华润大厦 2503B邮编：100005 电话：+86.(0) 10.85 19 20 70传真：+86.(0) 10.85 19 20 71 电子邮件：dialogvirion-网址：http:/www.virion-2弓形虫 IgM 抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）说明书赛润 ELISA classic 目录1. 名称2. 用途3. 诊断意义4. 说明5. 赛润 ELISA cl
2、assic - 检测原理6. 试剂盒组成7. .检测所需物质，试剂盒未提供8. 储存和稳定性9. 赛润 ELISA classic 的检验步骤9.1 注意事项9.2 样品准备和储存9.3 试剂盒反应试剂的准备9.4 检测程序概要9.5 检测过程10. 检测结果评估 10.1 4PL 单点定量法10.2 检验有效性标准10.3 计算赛润 ELISA classic 弓形虫 IgM（定量）10.4 检测结果分析11. 弓形虫 IgG 抗体的亲和性测定12. 性能特性12.1 重复性12.2 敏感性和特异性12.3 亲和性测试13. 有效期14. 警告13.1 警告和安全措施13.2 废料处理15.
3、 参考文献16. 制造商名称、地址及联系方式 3弓形虫 IgM 抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）赛润 ELISA classic酶联免疫法测定人体抗体（IgM）- 只限用于体外诊断-1. 名称通用名：弓形虫 IgM 试剂盒 (定量) 英文名：Toxoplasma gondii IgM (quant.) 商品名：赛润 ELISA classic 弓形虫 IgM 抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）汉语拼音：Serion ELISA classic Gongxingchong IgM kangti dingliang jiance shijihe (meilian mianyifa) 产品编号: ES
4、R110M检测评估标准: Dade Behring BEP III / BEP 2000, DSX, 手动操作 2. 用途用于定性和/或定量检测人血清或血浆中的抗弓形虫抗体。3. 诊断意义赛润 ELISA classic 弓形虫 IgM 抗体定量检测试剂盒主要用于定性和 /或定量检测人血清或血浆中的抗弓形虫抗体，以测定免疫状态，以及确定急性感染。IgG-ELISA 试剂盒是用于弓形虫抗体的筛查试验。配合 Serion（赛润）弓形虫亲和性试剂（货号：B110AVID）使用可以测定 IgG-抗体的亲和性。另外，IgM- ELISA 试剂盒适合用于新生儿的筛查，也就是说通过检测新生儿血液的滤纸干血片
5、的 IgM 抗体来进行诊断。弓形虫是一种真核生物病原体，属于孢子虫纲。这种必须寄生在细胞内的寄生虫散播在世界各地，其孢囊繁殖的特点是能够在有性繁殖（只有在最终宿主猫科动物中才会进行有性繁殖）和无性繁殖之间转化。弓形虫经口进入体内（如食用被污染的食物）后，会穿透肠道进入网状内皮系统，它能通过血液传播，感染宿主体内许多不同的器官和组织。弓形虫在正常人群中的传播与年龄有密切的关系，50 岁的人群中血清阳性率接近 50%，年龄每增长 10 岁，弓形虫抗体的血清阳性率就会以 10%的幅度增加。环境和营养因素也有很重要的意义，可以对弓形虫的血清阳性率产生显著的影响。弓形虫感染后，大约 50%的人没有临床症
6、状，而另外 50%的感染者经过 1-3 周的潜伏期后，只有一些非特异性症状如低烧、疲乏、头痛、肌肉和关节痛；少数病人会出现高烧（至 39）和颈部淋巴结肿大。据报道儿童和未成年人感染后有1%的病人还会出现并发症如心肌炎、脑膜炎或肺炎等。患者康复后，弓形虫细胞会在感染组织中持续存在并形成胞囊，能阻挡机体免疫系统的攻击。这就是通常所说的潜伏期，在免疫力正常的宿主体内不被激活。或许由于抗原的存在对机体产生长期的刺激，使机体获得终生免疫力。孕妇弓形虫感染的筛查是有重大意义的。有关研究表明：弓形虫通过胎盘传播在怀孕的各个阶段都有可能发生，但产前传播和感染率的高低与怀孕的不同阶段有密切关系。1. 第 1-3
7、 个月 17% （最常见的是流产, 很少对胎儿造成严重伤害）2. 第 4-6 个月 24% （会对胎儿造成中级或严重的伤害）3. 第 7-9 个月 64% （会对胎儿造成轻度伤害或晚期对胎儿有致命性伤害）初期感染但血清学检测呈阴性的孕妇，通过胎盘传播感染胎儿的风险较低，据报道在德国新生儿的感染率为 2-7。4因为一次感染以后，弓形虫 IgM 抗体很可能持续存在数月或者数年，所以很多时候检测出病原体特异性的 IgM-抗体，并不意味着存在妊娠相关的弓形虫现行感染。针对带有阳性弓形虫 IgM 抗体的血清，亲和性测定可以实现新近初期感染的继续鉴定，因为高亲和性弓形虫 IgG 抗体的前提是更长的既往感染
8、点。仅有 1-3%的被感染新生儿会立即出现弓形虫病的临床症状，但在约 80%的无症状（被感染的）新生儿中，部分会出现严重后期伤害。赛润 ELISA 刚地弓形体 IgM 检测可以有效地对无证状的新生儿进行筛查。该实验通过检测新生儿的滤纸干血片来实现（见赛润新生儿弓形虫检测说明书） 。在新生儿体内检测到病毒特异性 IgM 抗体即表示婴儿已被该种病原体子宫内感染或者急性感染， ，因为母体的 IgM 抗体基于其体积过大不可能通过胎盘传输。针对弓形虫感染可对被感染的新生儿进行及时的治疗，以避免继续的后期伤害。直到怀孕前两周感染弓形虫都会形成免疫。在计划怀孕时，在怀孕前进行一次血清学检测是非常有意义的。母
9、亲首发感染发现后直接治疗，可使胎儿被感染的风险降低 75%。机体出现自然的或有医疗引发的免疫抑制后，潜伏期感染会被激活。在艾滋病人群中，弓形虫脑炎已成为最关键的、也是最终的致死病因。甚至近期有报道显示：弓形虫感染会随免疫抑制的出现而相继发生。4. 说明本说明书除弓形虫 IgM 抗体定量检测的内容外，还涉及到 IgG 抗体的定量检测，以及对结果的分析等。5. 赛润 ELISA classic - 检验原理用抗原包被微量板孔，制成固相载体。加患者血清到板孔中，其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。除去多余物质后，加入碱性磷酸酶标记的 IgG 和 IgM 抗体，使之与上述免
10、疫复合物反应。洗板，除去多余的结合物，加入底物（对硝基苯磷酸盐） 。其与酶结合的免疫复合物反应，产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。6. 试剂盒的组成试验成分 IgG 试剂盒 IgM 试剂盒 数量 / 容积微孔条（此微孔条可拆下单独使用，每条有 8 孔，共 96 孔，已经包被了抗原）1 个微孔条框架包被的抗原为灭活抗原12 12标准血清（立即可用）人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；抗 HIV 抗体、抗乙肝病毒（HBV ）表面抗原和抗丙肝病毒（HCV）抗体均为阴性；防腐剂： 20 IU/ml临界值结果: 10-20 IU/ml阴性结果: 350 IU/ml临界值结果: 300-350
11、IU/ml阴性结果: 300 IU/ml针对临界值结果的样品，应在 1-2 周后对相应的病人再进行取样，重新检测。10.3.2 利用 SERION easy base 4PL 软件/SERION 评估软件进行自动评估输入四个参数和标准血清参考值之后，联机软件就会计算出抗体活性。如果标准血清的消光值超出有效范围，SERION easy base 4PL 软件就会出现如下信息：“标准已超出允许范围” 和 / 或 “标准差异大于 20%”。SERION 评估软件只用英语显示：Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24.
12、Standard value differ more than 20% in following groups: Group 1-24.” （“以下组样品标准值超出范围：组 1-24。以下组样品标准值差异大于 20%：组 1-24。 ” ）在这种情况下，此轮试验无效，需重做。只有更换批号时，参数和参数值才需要改变（评估表中标有参数与参考值） 。组别特异性数据的正确输入与否可以以标准血清的 IU / ml 或 U / ml 值为基础进行检验。计算出的平均单位值需与组别特异性认证书所示的单位值相对应。可自动校正测定值。使用标准版本打印机会显示如下内容：样品编号OD 值IU / ml 或 U / m
13、l结果说明10.4 检测结果说明在此为孕妇的血清学检测推荐一种阶梯式诊断（Robert Koch 研究院）12赛润 ELISA classic 弓形虫 IgG 试剂盒可用于筛查试验。赛润 ELISA classic 弓形虫 IgG 检测的阴性结果（10 IU/ml）表示没有获得免疫力，但并不完全排除处于一种急性感染的极早期，还没有形成抗体。在这样的情况下，孕妇及计划怀孕的妇女由于免疫力降低，感染胎儿的机率会很高。因此强烈建议间隔 8-10 周后再取样检测。血清阴性的女患者应进行常规（最大间隔 12 周）检测，因为在此期间可能与病原体形成接触但经常没有显眼的弓形虫感染症状。IgG 结果阳性，并且
14、之后的赛润 ELISA classic 刚地地弓形虫 IgM 检测为阴性，可以得出是被检测者接触过弓形虫之后的潜伏性感染。这种情况下对胎儿不存在危害。在弓形虫 IgM 抗体测定时，尤其是同时伴有高或者不断升高的 IgG 抗体浓度时，必须考虑可能是首次急性感染。检测出的 IgM 抗体并不一定表示弓形虫急性感染。在挪威的一项调查中对 35940 位孕妇做了弓形虫抗体检测（Jenum, P.A. et al.） 。在被检测出带有弓形虫 IgG 抗体的 3907 位孕妇，有 266 位是带有弓形虫 IgM 抗体的患者，这其中只有30 位孕妇的 IgM 抗体测定与原发感染有关。弓形虫 IgM 抗体可以持
15、续存在多年。此外还需注意的是，由于多边刺激（比如由于 EB 病毒）而可能造成的弓形虫 IgM 结果阳性，并不表示近期感染。在怀孕预防措施的范围内，提供 IgG 抗体亲和性测试。因为它操作简便，所有检测出弓形虫 IgM 抗体（包括那些浓度很低）的孕妇血清，的都应该做这项检测。以避免忽略原发感染，提高安全性。在免疫反应的过程中，一般随着时间平均抗体亲和力（亲和力成熟）都会明显增强。因此高亲和性的 IgG 抗体说明（患者）有一个较早的既往感染时间点。反之，短期首发感染以低亲和性的 IgG 抗体的出现为标志。检测结果应按照以下表格（出自 Robert Koch 研究院）来评判：IgG IgM IgG
16、亲和性 在通常情况下，检测结果对应于下列感染：低 低 低或者高 无感染高 低 低或者高 既往感染高 高 低或者高 近期感染低 高 低 急性感染11. 弓形虫 IgG 抗体的亲和性测定针对弓形虫感染做亲和性测试的意义在于，该病原体不能只通过测定特异性 IgM 抗体来确定是原发感染。在此，弓形虫 IgG 抗体的亲和性测定可以为区分现行初次感染和已经超过 3-4 个月的弓形虫既往感染提供重要证据。亲和性测试的背景是，在分析针对某病原体的免疫系统的过程中观察越来越多的亲和力不断增强的抗体的形成，也就是说平均抗体亲和力增强。因此，高亲和性 IgG 抗体表明较长的既往感染时间。反之，较近的既往初次感染表现
17、出的特征是低亲和性 IgG 抗体的出现。试验操作赛润弓形虫亲和性试剂（货号：B110AVID）作为赛润 ELISA classic 弓形虫试剂盒的必要补充用于弓形虫 IgG 抗体的亲和性测定，亲和性试剂是以冻干粉形式存在。它是低粘性的，因此适用于自动仪器，没有腐蚀性，不是有害物质。试剂是 2ml 瓶装。在弓形虫 IgG ELISA 微孔板上准备双份经过稀释的标本。与常规的 ELISA 检测操作相比，亲和性测试的区别在于：在常规测试中的标本孵育（60 分钟，37）步骤之后，将微孔通过拍打或抽吸清空，然后向其中一个孔中滴入 150 微升洗涤缓冲液，另一个孔则滴入 150 微升的亲和性试剂。在孵育箱
18、中经过 37/8 分钟的作用时间后，可接着进行常规的洗涤步骤。用赛润 classic 弓形虫亲和性试剂进行亲和性测定是以已测得的 OD 值为基础的。在此已研发出一个公式，该公式在计算13校正的亲和性指数时，将对单个标本的特异性抗体浓度的影响计算在内。通过将该赛润评估方法和以抗体量为基础的定量方法（PRINCE-WILSON 威尔逊王子的方法）将比较，该赛润方法显示出更高的准确性。一个以 EXCEL 表格为基础的评估助手用于计算校正的评估高亲和性或者低亲和性的亲和性指数，该评估助手可申请索取。该赛润评估助手同时可计算出每个标本的弓形虫 IgG 抗体含量。此外抗体量为基础表示的亲和性指数还可实现与
19、其它商业上通用的弓形虫亲和性测试进行比较。其它关于弓形虫亲和性测试的详细说明请查阅赛润弓形虫亲和性试剂中随盒附上的使用说明。12. 性能特征12.1 重复性检测内结果的重复性通过在同一批试验中检测 20 次不同反应的血清来判断，而检测间结果的重复性通过分别在 5 天进行10 次独立的血清检测分析来判断。标准差差异系数 (CV) =平均值 100赛润 ELISA classic 弓形虫 lgG:平均消光值 (OD)检测内分析(CV%)平均消光值 (OD)检测间分析(CV%)样品弱阳性阳性强阳性0.5590.8341.6538.38.05.60.5350.7771.50014.410.012.8赛
20、润 ELISA classic 弓形虫 lgM:平均消光值 (OD) 检测内分析(CV%) 平均消光值 (OD) 检测间分析(CV%)样品弱阳性阳性强阳性0.3020.9381.1465.054.85.310.2020.9361.1429.896.535.7912.2 敏感性与特异性对450份来自病人和健康人的血清样品用赛润ELISA classic 弓形虫 IgG试剂与间接免疫荧光法分别检测，进行对比分析。使用赛润ELISA classic 弓形虫 IgM和其他厂商生产的弓形虫 IgM-Capture ELISA检测76份血清并进行对比分析，能够确定赛润ELISA classic弓形虫IgM
21、其敏感性和特异性。在计算时不考虑临界值血清。赛润 ELISA classic IgG 检测 赛润 ELISA classic IgM 检测敏感性 98.2% 100%特异性 99.4% 97.2%在一个附加试验中，用赛润 ELISA classic 弓形虫试剂和间接免疫荧光分析（作为对照试验）分别对来自怀孕妇女的 1000份血清样品进行了检测。两种方法检测结果不一致的样品再用第 3 种方法 SabinFeldman 染色试验(Sabin Feldman Test)进行检测。赛润 ELISA classic IgG 检测14敏感性 99.7%特异性 99.5%结果表明：赛润 ELISA clas
22、sic 弓形虫 IgG 试剂盒能很好地适用于对怀孕妇女特异性抗弓形虫抗体的检测。血清中血红蛋白浓度达到 10mg/ml 时也不会影响试验结果。对一组带有抗潜在交叉反应因素的抗体活性的血清（带有自动抗体和吸附因子的血清，以及 EB 病毒-和梅毒感染的血清）进行检测，未得出基于交叉反应的假阳性结果。EB 病毒感染可以导致一种多细胞刺激，从而导致弓形虫检测结果的假阳性现象。此外还需注意，弓形虫 IgM 抗体可以持续存在数月甚至数年。将于赛润 ELISA classic 弓形虫 IgM 试剂盒的临界值确定在 300-350U/ml 是以以下莱比锡大学医用微生物学以及传染流行病学研究院所做的外部研究试验
23、的结果为基础的，采用了 BioMerieux 公司的 VIDAS TOXO IgM 试剂盒以及 ELISA Enzygnost Toxoplasmosis/IgM 做对比试验。从该研究得出，赛润 ELISA 试剂盒达到一个 98.6%的相当好的特异性。所得出的敏感性为确定临界值 450-550U/ml，位于对比试剂的敏感性之间，也就是说它低于 VIDAS，并且高于 Enzygnost。在该外部研究的总结评论中，建议将临界值缩小为 300-350U/ml，因为这样的话，该临界值可以在极少的特异性失效的情况下拥有更高的敏感性。12.3 亲和性测试重复性批内重复性通过不同的亲和性血清在一个包被有抗原
24、的板上进行多次试验（n=10）计算得出。批间重复性通过将不同亲和性的血清样本进行 10 个互不相关的试验来检测确定。批内试验 批间试验 血清亲和性指数平均值 (%)VK (%)亲和性指数平均值 (%)VK (%)T 60U 35SLU.EG2783,468,931,611,15,110,99,111,781,866,837,514,33,98,813,99,7为了计算单位值范围 20-1000IU/ml 内的重复性，将高滴度的弓形虫 IgG 血清 SGU.EN 每次 10 倍进行逐步稀释。血清SGU.EN(稀释)抗体滴度中间值(IU/ml)亲和性指数平均值(%)变异系数( %)1:5001:1
25、0001:40001:80001:1600075937584412059,063,169,572,371,57,38,612,24,013,215诊断特性在对一组已知亲和性的血清进行检测时，所有 34 个标本的结果都符合预知的“低亲和性”或者“高亲和性” 。赛润classic 弓形虫亲和性测试因此可以有效区分高亲和性的和低亲和性的弓形虫 IgG 抗体。在 148 份据估计应该带有高亲和性弓形虫 IgG 抗体的献血者血清中，检测出 145 份血清确为高亲和性，其它 3 份为低亲和性或位于临界值。在这样一组血清中检测出少量低亲和性的血清符合了引用文献中的陈述，即表示个别患者亲和力成熟度延迟或不足。
26、该结果表明，赛润亲和性测试能够正确识别高亲和性血清。13. 有效期2-8贮存，有效期详见试剂盒包装，具体各部分有效期在“8.储存和稳定性”中详述。14. 警告14.1 警告和安全措施赛润 ELISA classic 试剂盒是针对熟悉实验室操作人员所设计使用的。所有试剂盒试剂及人类标本必须采用已有的良好实验技术，小心处理：- 此试剂盒内含人血成分。尽管所有的对照及定点对照都已经过试验验证并且发现对于乙型肝炎表面抗原，丙型肝炎抗体，HIV 抗体均为阴性；但仍认为它们具有潜在的感染性。- 移液过程禁止用口。- 在处理试剂和标本的地方禁止吸烟，饮食。- 使用试剂盒和标本时，必须戴一次性手套，穿试验服，
27、戴安全镜。使用后请彻底洗手清洁。- 患者样本及其他潜在感染材料试验后应予以消毒。- 试剂应保存在安全的地方，禁止儿童接触。- 终止液：具有腐蚀性（C） ；发生酸烧伤（R34） ；因此在操作时应穿戴防护镜，手套和试验服。14.2 废料处理请注意相关要求！15. 参考文献Balsari, A. et al.ELISA for Toxoplasma antibody detection: a comparison with other serodiagnostic testsJ. clin. pathol. 33, 640, 1980Blatz, R.Gutachten zum SERION ELI
28、SA classic Toxoplasma gondii IgM (quant.)Institut fr Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der universitt Leipzig, erstellt am 05.12.2005Boniolo, A. et al.ELISA for Toxoplasma antibodiesIn: Immunoenzymatic assay techniques“, Malvano, R. ed., Nijhoff, M., Publ.,1980Hlobil, H. et al.E
29、pidemiologie, Prophylaxe und Therapie bei Toxoplasma-Infektionen in derSchwangerschaft-eine kurze bersicht-Klin. Lab., 687-693, 199216Janitschke, K.Prnatale bertragung der Toxoplasmen von der Mutter auf das Kind.Bundesgesundheitsblatt-Gesundheitsforschung-Gesundheitsschutz (42) 548-552, 1999Janitsch
30、ke, K.Toxoplasmose: Diagnostik im Rahmen der MutterschaftsvorsorgeDiagnose&Labor 39, 24, 1989Jenum, P.A. et. al.Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected womenJ. clin. Microbiol., 36, 2900, 1998Prince, H.E. et. al.Simplified assay
31、for measuring Toxoplasma gondii immunoglobulin G avidityClin Diagn Lab Immunol, 8, 904, 2001Robert-Koch-InstiutVirusdiagnostik und Toxoplasmose-Diagnostik vor und in der Schwangerschaft.Epidemiologisches Bulletin (22) 178 - 179, 2000Robert-Koch-InstitutVirusdiagnostik und Toxoplasmose-Diagnostik vor
32、 und in der Schwangerschaft.Epidemiologisches Bulletin(22) 178-179, 2000Van Loon, A. M. et al.Enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of Toxoplasma antibodies in human seraJ. clin. Pathol. 33, 635, 1980Walls, K.W., et al.Use of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and ist microad
33、aption for the serodiagnosis of toxoplasmosisJ. clin. Microbiol., 5, 273, 1977Welch, P.C., et al.Serologic diagnosis of acute lymphadenophatic toxoplasmosisJ. Inf. Dis., 142, 256, 198016. 制造商名称、地址及联系方式16.1 德国维润赛润研发有限公司弗里德里西-贝尔吉伍斯-里英大街 19 号 D-97076 维尔茨堡，德国电话：+49.(0)931.30 45 0传真：+49.(0)931.30 45 100电子信箱：dialogvirion-serion.de网址: www.virion-serion.de16.2 德国维润赛润研发有限公司北京代表处北京建国门北大街 8 号华润大厦 2503B 邮编：100005 电话：+86.(0) 10.85 19 20 70传真：+86.(0) 10.85 19 20 71 电子邮件：dialogvirion-网址：http:/www.virion-
