1、第37卷第12期 2015年12月 宜春学院学报 Journal ofYichun CoUege VoL 37，No12 Dec2015 血液中氨基酸含量的高效液相色谱及其 质谱联用测定方法研究进展 王清华 。熊筱娟 。张凤 ，高守红 (1宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春336000； 2g-军医大学长征医院药学部，上海200003) 摘要：综述液相色谱法和液相色谱一质谱联用法测定血液中氨基酸含量的研究进展，评述 了每种分析方法的特点和适用范围，为临床诊断相关代谢疾病提供辅助依据。 关键词：氨基酸；血液；液相色谱法；液相色谱一质谱联用法；分析方法 中图分类号：R917文献标识码：A文章编
2、号：1671380X(2015)12007604 Research Progress of Analysis Methods for Amino Acid in Blood耐th HiglI Performance Liquid Chromatography and I噩gh Performance Liquid Chromatography Coupled tlI Tandem Mass Spectrometry wANG Qinghua，XIONG Xiaojuan ，ZHANG Feng ，et al (1College of Chemistry and Bioengineering，Y
3、hun Unwehy，Ywhun 336000，China； 2Department ofPharmacy，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China) Abstract：In this paper，we summarized the progress in research of analysis methods for amino acid by hish per- formance liquid chromatography and high performance liquid
4、 chromatography coupled witIl tandem mass spectrome try in bloodThe characteristics and印plication range of each analyze method were reviewed to provide a reference for clinical diagnosis of related metabolic diseases Key words：Amino Acid；Blood；High Performance Liquid Chromatography；High Performance
5、Liquid Chroma tography Coupled with Tandem Mass Spectrometry；Analyze Method 氨基酸是机体代谢的重要物质之一，具有广泛 的生物学功能，是构成生物机体蛋白质分子的基本 组成单位和维持内稳态重要的物质基础。人体内参 与氨基酸代谢的相关蛋白和酶发生缺陷或者各种病 理状态都会导致氨基酸代谢异常和血液氨基酸水平 的改变。例如，对称二甲基精氨酸(SDMA)和非 对称甲基精氨酸(ADMA)的变化能够较好地反映 在肾脏疾病中肾功能受损伤的严重程度。【l 因此， 监测生物样本中(血液、尿液等)的氨基酸含量 具有重要的意义，6 在临床上观测
6、氨基酸的动态 变化行为可以为相关疾病的诊断提供辅助依据。 目前，有关氨基酸分析方法研究的报道比较多， 常用的有氨基酸分析仪测定法(amino acid analyzer， )、高效液相色谱法(H曲一performance liquid chromatography，nPLC)，气相色谱法(gas chroma- tography，GC)，毛细管电泳法(Capillary electrophore sis，CE)等。近3O年来，随着质谱分析技术的出现 与普及，作为一新兴的技术已经运用到了生命科学、 生物化学、医学、食品等领域。因此，作为高特异 性和高灵敏度检测工具的质谱，同样在分析生物样 本中小
7、分子氨基酸含量发挥着重要的作用。I】 -13本 文主要对HPLC，液相色谱一质谱联用(HPLC MSMS和uPLCMSMS)等技术在氨基酸定量分 析中的应用进行了综述和评价。 1液相色谱法 ， 由于氨基酸的极性比较大，在普通的C18反 相色谱柱上保留行为极差，因此，在复杂的生物样 本或非生物基质中，广泛地定量氨基酸是一个极大 的挑战。在过去的60年里，研究者为了使生物样 本中的氨基酸能够达到有效地分离与检测，常用的 收稿日期：201507一o5 作者简介：王清华(1985一)，男，tJ Jl泸县人，硕士研究生，研究方向：临床药学，Email：13761555621163corn。 $通讯作者：
8、熊筱娟，女，教授，硕导，主要从事药理研究，Email：ycxxxj163corn。 76 第l2期 王清华，熊筱娟，张风，等：血液中氨基酸含量的高效液相色谱及其质谱联用测定方法研究进展第37卷 分析方法是离子交换色谱分析结合茚三酮柱后衍生 化法，此法首先将氨基酸分离，再进行衍生化处理 并进行紫外检测。此方法样品用量大且缺乏特异 性， 氨基酸衍生化后，必须在紫外条件下检测， 灵敏度低，不适合某些微量氨基酸定量，且成本代 价高；柱前衍生化HPLC法，采用不同的衍生化试 剂，例如丹磺酰氯(Dansy|一c1)、异硫氰酸苯酯 (PITC)、邻苯二甲醛(OPA)、6一氨基喹啉一N一羟基 琥珀酰 披基甲酸
9、酯(AQC)等，样本处理步骤复杂，干 扰因素较多，分析时间长且耗费高，且无法达到临床上 高灵敏、高通量、高特异性的分析要求。在临床血液样 本中，化合物数量多且复杂，一些化合物跟氨基酸结构 相似或分子量相同，则有可能保留时间相同，有可能分 析物无法分离，造成成分的不确定因素，此外，血液是 体内样本，分析物往往需要内标物校正，而内标物最好 的选择是相应同位素的化合物，但是柱前衍生化法不 适合分析同位素样品。 2液相色谱一质谱联用法 传统分析氨基酸采用柱前衍生化和柱后衍生化 分析方法，使其生成具有紫外或荧光基团的衍生化 合物后进行检测。但是方法操作复杂繁琐、内外影 响因素较多、耗费时间较长，费用较高
10、，给I临床血液 样本检测带来了极大的不便，技术难以推广应用。 新兴的各种串联质谱技术的出现，广泛地运用 到各种大分子和小分子化合物的检测，从传统的方 法中脱颖而出，并应用到医学领域，如临床诊断治 疗、药物分析等各个分支学科。在HPLCMSMS 分析中，研究者们同样采用衍生化法分析氨基酸，虽 然缺乏特异性，但极大地缩短了分析时间，而且灵敏 性高。Yohei等 通过HPLCMSMS方法和衍生 化技术在20 min内完成了21种氨基酸的定量，LOD 达到了51fmol。Shimbo等 采用APDS(3一amin opyridylNhydroxysuccinimidyl carbamate)柱前衍 生
11、化22种哺乳动物血浆氨基酸后，通过HPLCESI MSMS在10 min之内完成分析定量。无论是从 分离性能上，还是从分析时间和灵敏度上比较， HPLCMSMS都要比传统的HPLC、氨基酸分析仪 等都要优越。 由于衍生化技术的操作复杂、耗时性以及缺乏 特异性，无法适用于f临床血样样本的高通量分析。 近年来研究者们通过不断的研究与探索，采用挥发 性离子对试剂，如七氟丁酸(Heptafluorobutyric Acid，HFBA)、九氟戊酸(Nonafluorovaleric Acid，NF VA)、全氟庚酸(Tridecafluoroheptanoic acid，TDF HA)等，不需要对氨基酸
12、进行衍生化就可以对其进 行直接分析，简单、快速、准确的高效液相色谱一串 联质谱法逐渐开始在复杂生物基质中氨基酸分析发 挥主导地位。Zoppa等 研究一种HPLCESI MSMS定量或定性分析新生儿干燥血点的氨基酸， 不需要衍生化试剂，直接在流动性中添加TDFHA， 在10min之内就分析完4O种氨基酸以及同分异构 体。Le等 在流动相水相系统添加ImmolL TDF HA，开发了一种快捷而灵敏的UPLCMSMS定量 法，分析33种血浆氨基酸只运行了10rain，并且与 氨基酸自动分析仪对比拟合分析，线性拟合度达到 R 096以上，可以完全替代传统的氨基酸分析 仪。与传统的方法相比，结合离子对试
13、剂分析氨基 酸，LCMSMS技术具有高特异性，高灵敏性和高 通量分析的优势(见表1)，为临床分析生物标志物 的探索、解说疾病的机理等提供了良好的技术平台。 表1氨基酸检测方法对E匕 Table l Comparison of detective meods of amino acids analysis 检测方法 优点 缺点LOD(tunolL) 77 第12期 宜春学院学报 第37卷 3血液中氨基酸检测的临床应用 现代生物医学观点认为，疾病在本质上是一个 从基因失调开始，经表达异常、代谢异常、功能失 调、机构改变直至产生临床表现的生化改变过程。 一旦出现临床症状、体征或形态结构改变，疾病实
14、际上已处于发生发展的终末阶段。代谢是机体最为 重要的一环，特征代谢物的出现或者改变一般要远 远早于传统的病理学终点。在生化分子发生变化的 阶段，并未检测到任何组织病理学的改变前，此时 对疾病进程的干预使得疾病的治愈有极大的可能 性。血液氨基酸在体内维持着一个动态平衡体系， 是机体代谢重要的一环，很多代谢疾病，如肿瘤、 糖尿病、肝病、前列腺癌、肾毒性等都会导致氨基 酸代谢紊乱。Yuan等_l 运用HPLC测定帕金森病 (Parkinsons Disease，PD)的血液神经递质类氨 基酸时发现，在疾病的早期门冬氨酸、谷氨酸、牛 磺酸、丝氨酸和谷氨酸与 一氨基丁酸的比值呈显 著下降的趋势，有助于早
15、期预测帕金森病。Nagata 等 通过液质串联质谱分析日本妇女绝经前的血 浆氨基酸图谱，提出精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、门 冬氨酸的紊乱能够评估乳腺癌发生的风险率。 Magnusson 等采用HPLCMSMS连续l2年监测 心血管患者血液中氨基酸，发现异亮氨酸、酪氨 酸、苯丙氨酸的含量变化在预测糖尿病的同时也可 以预测心血管疾病。 4结语 血液中的氨基酸是代谢组学中最重要的一个环 节，因此监测其含量可以辅助临床诊断或提供重要 的疾病分析依据。目前为止，检测氨基酸的方法众 多且都具有各自的特点，选择适合的检测方法一直 倍受到医学界的重视。新兴的高效液相色谱一质谱 联用技术具有快捷、准确、高灵敏性、高
16、特异性及 高通量的优势，将成为临床分析氨基酸以及其它代 谢疾病分子的主流。 参考文献： 1Fleck c，Schweitzer F，Karge E，et aL Serum concentrations of asynunetfic(ADMA)and symmetric(SDMA)dimethyl arginine in patients with eonic kidney diseasesJClin Chim Acta，2003，336(12)：112 2Kielstein JT，Salpeter SR，Beeger SMB，et a1Symmetric dimethylarginine(SD
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18、 4Wahbi N，Dalton RN，Turner C，et a1Dimethylarginines in chronic renal failureJJ Clin Pathol，2001，(54)：470 473 5Kielstein JT，Lobenhoffer Ji，Vollmer S，et a1LA蟛一 nine，ADMA，SDMA，ereatinine，MDRD formula：detour to renal function testingJ。JNEPHROL，2008，(21)：959 961 6A1一Dirbashi OY，AbuAmero KK，Mswaid AF，et a
19、1LC MSMS determination of dibasic amino aeid8 for the di- agnosis of cystinuriaApplication in a family affected by a novel spliceaceeptor site mutation in the SLC7A9 gene JJ Inherit Metab Dis，2007，30(4)：611 7Sowen J，Pollard L，Wood TQuantification of branched chain amino acids in blood spots and plas
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21、on between artherosclemtic patients J1J Pharm Biomed Anal，2012，(70)：476484 9Gu L，Jones AD，Last RL Rapid LCMSMS profiling of protein amino acids and metabolically related compounds for largescale assessment ofmetabolic phenotypesJMeth- ods Mol Biol，2ol2，(828)：11lI 10Wang c，Zhu H，Pi z，et aL Classifica
22、tion of type 2 diabetes rats based on urine amino acidsmetabolie profiling by liquid chromatography coupled with tandemmass spectrometryJJ Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013(935)： 2631 11Soto ME，Ares AM，Bemal j，et aL Simultaneous determina- tion of tryptophan，kynurenine，kynurenic and x
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25、，14(1)：557566 第12期 王清华，熊筱娟，张风，等：血液中氨基酸含量的高效液相色谱及其质谱联用测定方法研究进展第37卷 14Kaspar H，Dettmer K，Chan Q，et a1Urinary amino acid a nalysis：A comparison ofiTRAQ(R)一LCMSMS，GC MS，and amino acid analyzerJJ Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877(2021)：1838 1846 15Yohei s，Tomoya K，Taiehi Y，et a1A novel
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30、床疗效和生活质量 (1)轻度放脑。胞二磷胆碱联合组较地塞米 松单药组疗效、生活质量分别为9Ooo、 8103和7504、7803，P 0005，临床疗效(患者症状，体征明显改善及影 像学MRI病灶缩小明显或消失)明显，但生活质 量不明显。(2)中、重度放脑。胞二磷胆碱联合 组较地塞米松单药组疗效和生活质量分别为 7900、8503和5204、6603P001 临床疗效和生活质量效果均明显。 因此，胞二磷胆碱联合治疗组(在中重度放 脑)临床疗效和生活质量均较地塞米松组明显改 善。但轻度放脑生活质量改善不明显，可能与轻度 放脑生活质量改变不大有关。 34不良事件 两组药物治疗均未发生不良事件，具有
31、一定的 临床治疗药效。 4结论及分析 胞二磷胆碱营养脑细胞，促进受损脑细胞恢 复；复方血塞通扩张血管及活血化瘀，增加脑细胞 氧流量；高压氧使血脑屏障打开及脑血管氧分压增 加，促进脑细胞氧吸收，减轻脑细胞水肿，加快受 损脑细胞恢复，且三者有协同作用。地塞米松仅有 消炎、消水肿抗免疫作用。故胞二磷胆碱+血塞通 +高压氧联合治疗组较地塞米松单药治疗组轻度放 射性脑病临床疗效(患者头晕、头痛及记忆力减 退等症状，认知功能体征明显改善及放疗后脑水 肿、脑梗死、脑白质髓鞘变性等影像学MRI病灶 缩小变淡明显或消失)明显，但生活质量不明显； 在中重度放脑中除头晕、头痛、嗜睡、四肢甚至 全身痉挛抽搐及近、远期
32、记忆力减退等症状，人格 改变、注意力降低、痴呆等认知功能体征明显改善 及影像学MRI病灶缩小明显或消失等疗效更明显 外，还有ORR、DCR明显优于地塞米松单药组。 避免地塞米松长期应用有骨质疏松、肝损害及水钠 储留、血糖升高、胃溃疡等副作用，重复性高，价 廉和改善生活质量。 5讨论 近年来，我国鼻咽癌发病率有上升势头，鼻咽 癌又有其特殊性，较隐蔽，早期不易发现，发现较 晚，侵犯范围大，副作用大。尽管放疗设备和放疗 技术较大改进，放射性损伤明显减少，但有些副作 用仍不可避免。综上所述，随着患者生存期越长， 放疗损伤越来越突出，尤其放脑更明显。而胞二磷 胆碱联合治疗组ORR、DCR明显优于地塞米松组， 副作用不大，重复陛高，价廉。因此取得较好社会 效益，值得临床推广。 参考文献： 1彭慧平，卢晓欣，汤永建高压氧在肿瘤治疗及放疗并 发症防治中的应用J国外医学(物理医学与康复学 分册)，2004，24(01)：3246 2张雪林，阎卫平，邹常敬，等鼻咽癌放射治疗后放射 性脑病的MRI诊断J中华放射学杂志，1995，29 (10)：658662 3阎卫平，陈永清，吴德华，等磁共振成像对鼻咽癌放 射性脑病的观察EJ3中国放射肿瘤学，1991 (5)：53 79
