Odyssey 红外荧光扫描成像系统培训手册1.pdf

1、 Odyssey 红外荧光扫描成像系统 培训手册 二 oo 三 年 九 月 目 录 一、Odyssey 红外成像系统技术特点 二、系统安装条件 三、Western 实验所需试剂设备及样品 四、培训程序及时间安排 五、仪器及试剂系统介绍 六、Western 实验操作流程介绍 七、软件使用培训 八、常见问题处理 九、注意事项 一、Odyssey 红外成像系统技术特点 一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。而在红外波长区这些大分子物质几乎不发出任何

2、荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为可能。LI-COR 根据红外荧光的这一特点开发出 Odyssey 红外成像系统，独特的采用 2 个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。样品载体可以是膜、凝胶和微孔板。该系统配置的 2 个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和 780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm的发射荧光，因而 Odyssey 可同时检测两种 IRDyes 染料的荧光信号。 IRDyes 染料的最大吸收值与 Odyssey 的两个红外激光器 680nm 和

3、 780nm 激发波长相匹配，其发射光波长又与 Odyssey 的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时 IRDye700和 IRDye800 的发射波长峰值相隔 100nm，因此 Odyssey 可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉。同时由于采用二极管激光器和固态检测器， Odyssey 具有很长的使用寿命（激光器使用寿命约 4-6 万小时） ，而系统维护的要求却很低。该系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析， In-Cell-Western 分析等蛋白领域研究。 主要特点 1高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。 2直接检测，无需曝光和显色底物，不需要 X 光

4、片，不需要暗房，没有放射性废料产生。 3双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。 4宽广的线性范围，可用于高准确性定量。 5背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号 6强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易 7系统操作和维护简单 Odyssey 的应用 应用领域：蛋白质研究，核酸研究 具体包括：Western 分析，In-Gel Western 分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色 EMSA，双色微孔板分析，BD PowerBlot Analysis，Northern Blot，Southern Bl

5、ot等 二、系统安装条件 1. 位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射 2. 空间及载重要求： 操作平台尺寸（长宽高）：807080cm 操作平台载重：40kg 3. 温度要求：15-25 4. 湿度要求：不超过 60% 5. 电源：90-250V AC，47-63Hz。 6. 其它：通用插头接线板（至少 3 个插孔） 三、Western 实验所需试剂设备及样品 Western Blot 实验所需试剂耗材 ： 客户自备的蛋白样品(建议为新鲜制备的蛋白，最好用 western 验证过) 细胞裂解液 SDS-Page 胶 电泳缓冲液 硝酸纤维素膜 转移缓冲液 PBS TBS

6、封闭液（建议使用 5%进口脱脂奶粉） Tween-20 一抗 荧光标记的二抗（IRDye700 和 IRDye800） 锡箔纸 （通用试剂详细配方请参照分子克隆实验指南） 其它配套设备： 1) 蛋白电泳仪 2) 脱色摇床 3) 转膜仪 4) 分子生物学实验室常用工具： 加样器，Tip 头，量筒，离心管，离心机，冰盒等。 四、培训程序及时间安排 （请至少安排 2 名实验室长期工作人员参加培训，方便以后有人员变动您也能进行仪器内部培训。） 1. 仪器概况及相关应用讲座（1 小时） 2. 仪器使用培训（2 小时） 3. 用户实际操作练习与答疑（1 小时） 五、仪器及试剂系统介绍 1. Odyssey

7、 红外成像系统技术特点讲解 2. 仪器系统组成和工作原理讲解 3. 配套试剂介绍 六 Western 实验操作流程介绍 荧光检测 Western 操作流程（以硝酸纤维素膜为例） ： 1. 吸去培养液，用预冷的 PBS 洗细胞两次 2. 加入细胞裂解液，4放置 20min 3. 用细胞铲刮下细胞，转移到 1.5ml 离心管，13000rpm ，4 ，20min 4. 取上清 5. 取 20-100g 蛋白进行电泳 6. 电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）按分子克隆实验手册操作 7. 硝酸纤维素膜于转移缓冲液（PBS ）中平衡 20min。（ 如果使用 PVDF 膜，请先用甲醇浸湿，再用去离子

8、水冲洗后转移到转移缓冲液中平衡 20min。 ） 8. 电泳胶置转移缓冲液中平衡 20min。 9. 裁两张与胶同样大小的滤纸,置转移缓冲液中平衡。 10. 转膜顺序：负极专用滤纸电泳胶PVDF 膜专用滤纸正极。 15V，电转 30min。 11. 电转后，封闭液中封闭 13hour 。 注：封闭液可以用 5%的进口脱脂奶粉（用 PBS 溶解），因为 Tween-20 和 BSA 会对Odyssey 造成高背景，所以在封闭完成前尽量不要让膜接触到这两种物质，所以麻烦您确定封闭液中没有 Tween-20 和 BSA 成分。 12. 封闭液稀释一抗（建议比例为 1： 10001： 5000），膜在

9、一抗中室温至少 1hour或者 4过夜。 注：抗体的稀释倍数与抗体质量和实验中的蛋白样本相关，麻烦您根据经验选择合适稀释倍数。同时，不同的抗体可能需要在抗体稀释液中含有 0.1-0.2%的 Tween-20 来降低背景，您可以根据您要检测的蛋白以及平时操作经验来选择需否在一抗稀释液中添加 0.1-0.2%的 Tween-20。 13. 之后用 PBST 于摇床洗膜 45mins 。 14. 封闭液稀释二抗（建议比例为 1： 300010000），膜在二抗中室温于摇床 1hour（避光）。 注：如果一抗稀释液中含有 0.1-0.2%的 Tween-20，则二抗稀释液也添加相同的 Tween-20

10、。如果使用 Tween-20 的同时添加 0.01-0.02%的 SDS 于二抗稀释液中可以比较好的降低背景 15. 洗膜同 13（避光） 16. 用 PBS 洗去膜上残留的 Tween-20，接下来可直接进行扫描。 实验的详细的操作流程、注意事项、问题解决请参见附件以及分子克隆实验指南 。 仪器的操作流程： 1在面板上打开仪器电源开关，再开启电脑，关机时相反。 2用软布或无尘纸蘸双蒸水将扫描平面的玻璃擦拭干净。 3将要扫描的胶或膜放到扫描平面上，记下坐标，扣上舱盖。 4双击软件图标，输入用户名、密码，进入主菜单。 5点击 scan 快捷键，选择要扫描的区域、介质、通道及合适的灵敏度、分辨率，

11、开始扫描。 6扫描结束后对扫描结果进行分析。 7依次进行图象裁切、定道、定分子量标准、背景扣除等操作。 8根据需要输出图形或数据报告表格。 七 软件使用培训 以下是关于 Odyssey 配套软件的简要操作说明，便于初次操作的研究者能快速掌握如何使用软件进行扫描。关于进一步的如何使用软件对实验结果进行分析，请参见随机所带的英文原版使用手册。 一、如何进行图像的扫描： 1 双击桌面上 Odyssey 的快捷方式图标 打开软件出现软件的使用界面 2 点击工具栏中 图标，建立一个新的 case 软件提示选择 case 的途径和名称，点击 Browse，选择 case 存储的位置，并在 name栏中输入

12、 case 的名称，点击 Done，软件提示将文件存储到相应的位置中 点击确定，保存文件。 3 点击工具栏中 图标，该图标在可以进行扫描时变为彩色状态 系统提示输入用户名和密码，一般情况下用户名和密码均为 user，点击 OK，弹出扫描设置对话框，对扫描参数进行设置 Name： 输入本次扫描的名称 Group： 定义用户所归属的组别 Preset： 设定选择扫描界面 可以根据实验的要求进行扫膜、扫蛋白胶、扫 DNA 胶、扫 96 孔板等选择操作 Resolution： 扫描分辨率设定，在右侧下拉框里选择需要的分辨率，有 21、42、84、 169、 337 五种分辨率可选，这里分选择的值越小，

13、图像的分辨率越高，扫描得到的图像越大。一般的扫描我们推举使用 169 就可以得到 300dpi 的图像。 Quality： 图像的质量，在右侧的下拉框中选择需要的图像质量，一般的 Western blot 膜我们推荐使用 medium 即可。 Focus offset： 聚焦平面选择，一般情况下当在上面 Preset 中选择好扫描选项后，聚焦平面的值会根据上面的选择自动给出聚焦平面，一般来说，膜的聚焦平面为零，胶的聚焦平面为胶厚度的一半（可根据胶实际的厚度手动输入） Channels：选择扫描的激光通道，根据所使用的二抗其激发后产生的发射光波长为 720nm 或 820nm，选择相应的 700

14、 或 800 通道，如果同时使用两个通道，也可同时勾选这两种通道。 Intensity：在右侧的下拉框中选择激发光的强度，由 L2.0 至 10 共 24 种强度可以选择，根据信号的强弱进行调整，信号弱时可将激发光强度相应调高。在进行双通道扫描时，可根据不同的信号，设置不同的激光强度进行同步扫描。 Scan Area： 在四个选项框中可以手动输入值，或者在右侧的 2525 的扫描平面模拟图中圈选要进行扫描的面积。 4 扫描点击 Start Scan 按钮，开始扫描 扫描开始后，扫描的图像可以实时出现，在右下角可以看到完成的百分数 5 图像调整 当扫描达到 100后，扫描结束，弹出图像调整对话框

15、 Flip：图像位置颠倒选项，可以将图像进行上下颠倒 Rotate： 图像旋转选项，可对图像进行不同角度的旋转 Subtract： 在原始图像截选取需要的范围 Crop：将选取的范围裁剪下来 Undo：返回上一步 Adjust Image：调整图像的色阶 Alter Image：调整图像的亮度和对比度 在图像调整完成后，点击进入图像分析界面 二、如何对图像进行灰度分析 双击 Scan 下 Analysis 图标，打开图像，可以进行分析。 1 图像调整工具栏： 快捷图标 新建一个 project 打开已经存在的 project 打印显示的图像 扫描，由扫描仪获得图像 导出显示的图像，选择图像的分

16、辨率和格式，并选择相应路径进行保存 在已有的 Scan 下，再次添加新的 Analysis 显示选中的 Analysis 将已打开的图像，再次打开并平行窗口排列 图像放大 图像缩小 图像比例调整 去除或显示图像上的标注 对图像的亮度和对比度进行调整 对图像的的色阶进行调整 显示 700 通道图像或显示双通道图像 显示 800 通道图像 将图像转化为黑白色 显示彩色图像 显示图像设置参数 显示图像背景设置参数 显示选择圈选图像的细节 表格形式显示所圈选的图像 显示所选泳道的峰值图 调整图像在圈选框中的位置 对图像的灰度值和浓度值做标准曲线 编辑分子标准 2 图象分析工具栏 3 图象分析 A 打开

17、需要分析的图象，左侧的分析工具栏被激活 B 使用 矩形选择工具圈选图象上要分析的条带（尽可能小） C 系统自动给出该条带的灰度值 D 如果进行多个目标条带的分析，对多个目标条带进行圈选，然后拖动鼠标将所有矩形框选中，则多个分析结果可以同时显示 软件分析的详细功能，请参照仪器说明书，并和相关技术支持联系 八.常见问题处理 问题：高背景，但是是均匀分布的 可能原因 建议 封闭液中有 Tween-20 存在 在封闭完成前不要让膜接触到 Tween-20 封闭液中有 BSA 永远不要将 BSA 用于封闭或者抗体稀释，BSA 会造成不可逆的高背景 没有使用最佳的封闭试剂 对不同的封闭液进行比较找到最适合

18、自己体系的封闭液；另外可以延长封闭时间 硝酸纤维素膜上的背景 在稀释的抗体中加入 Tween-20 从而降低背景。Tween-20 的浓度需要根据所用的一抗进行优化， 一般为 0.05-1% PVDF 膜上的背景 减少或者除去稀释抗体中的 Tween-20， 特别是在使用牛奶作为封闭液的时候 抗体浓度太高 优化一抗和二抗的稀释倍数 洗膜不彻底 增加洗膜次数和洗膜液的量。 确保洗膜液中含有 0.1%的 Tween-20,必要时可提高 Tween-20 的浓度。 但要注意，过量的 Tween-20(0 .5-1%)可能会使信号减弱。 封闭液有污染，污染物和抗体发生交叉反应 用 Odyssey 配套

19、的封闭液，而不是牛奶。牛奶里经常会有 IgG,IgG 会和抗羊的二抗发生交叉反应。 使用的抗体量不合适 增加抗体的量，使膜完全浸没其中。 膜的污染 操作要小心，处理膜的时候使用镊子，要防止膜干掉。问题：背景上有不均匀的斑点分布 可能原因 建议 封闭液中同时处理了多张膜 如果多张膜同时放在一起进行封闭，请确保封闭液的量能够使所有的膜都能接触到溶液同时移动自如。 膜被 Ponceau S 污染 Ponceau S 和膜接触后即使 Ponceau S 已被洗脱仍会使膜的背景增高 膜没有始终保持湿润，部分被吹干 使膜始终保持湿润状态。特别是要重复使用膜的时候这一点非常重要。 如果使用 PVDF 膜，记

20、住要先把膜用 100%甲醇浸湿。使用的镊子和容器被污染 镊子在接触过抗体，特别是染料标记的二抗后要洗干净。脏的镊子会将染料带到膜上，无法洗脱。 孵育时使用干净的镊子和容器 问题：信号微弱或者没有信号 可能原因 建议 蛋白没有成功从胶中转移出来 检查转移液是否正常，检查转膜过程的各个步骤是否正确 用 Odyssey 预染 marker 指示转膜情况，另外转膜后对胶进行染色以确定没有蛋白留在胶中 检测过程中蛋白从膜上丢失 过 长 的 封 闭 时 间 或 者 抗 体 稀 释 液 中 高 浓 度 的Tween-20（0.5-1%）会导致膜上抗原部分丢失 使用的抗原量不足 增大跑胶时的上样量；使点样孔尽

21、可能的小从而浓缩抗原。 使用了错误的封闭液 为了提高灵敏度和结合得牢固度，使用 Odyssey 封闭液。 转移过程中蛋白没有保留在膜上 转膜后先让膜在空气中自然风干，再去封闭。这样能使蛋白结合得更为牢固。 根据所用的抗原对转膜条件和时间进行优化。检查转膜时的“三明治”中间是否有气泡。 尝试其他牌子或者类型的膜（不同的抗原同膜结合的能力不同） 在转移液中添加 20%的甲醇会有助于抗原同膜的结合（注意：甲醇会使胶的孔径缩小对大蛋白的转移会造成阻碍） 转移液中的 SDS 会降低转移的蛋白同膜的结合力，特备是那些低分子量的蛋白。尝试降低或者去除 SDS（注意： 溶液中不超过 0.5%的 SDS 对某些

22、蛋白来说确实能提高转移效率）。 小蛋白在转移过程中会穿过膜。使用孔径小一些的膜或者缩短转移时间。 使用的抗体量不足 一抗的结合力也许不够强。增加抗体的量，优化出最适合的浓度。 延长一抗得孵育时间（室温下 4-8 小时或者 4过夜）。 增加二抗的量，优化出最适合的浓度。 由于放置时间过长或者保存不当抗体失去作用；用dot blot 检测抗体。 膜的类型不合适 尝试另一种膜。硝酸纤维素膜要比 PVDF 膜灵敏度更高。 问题：出现非特异性或者非预期的条带 可能原因 建议 抗体浓度过高 减少抗体用量。 缩短抗体孵育时间。 增加抗体稀释液中 Tween-20 的量 双色实验中抗体间的交叉反应 对所用一抗

23、和二抗的来源、种属再次检查（请参照附件中关于双色 western 部分）。 双色实验中交叉反应很可能出现。减少二抗用量可使这种情况出现的机会降低。 双色反应之前先做一下单色实验，从而了解哪些是目的条带以及目的条带所在的位置。 如果可能的话，避免同时使用鼠抗和兔抗。因为这两个种属的亲缘关系很近，在某些情况下，鼠抗会和兔的 IgG 发生反应，兔抗也会和鼠的 IgG 发生反应。 信号从一个通道流失到另一个通道 如果某个通道的信号非常强（接近或处于饱和状态），其中一小部分的信号会流失到另一个通道。要解决这一问题，可以在扫描时减弱该通道的激发强度。同时在以后的实验中减少蛋白点样量以及使用的抗体量。九.

24、注意事项 1，操作环境的温度应保持在 1525之间，以保证激光头的正常工作。 2，操作环境的露点温度应保持在 20 度以下，否则可能造成激光头的损坏。露点温度的查询，可以访问下面的网址： http:/www.decatur.de/javascript/dew/。 注意：如果由于露点温度过高造成的仪器损坏，厂家不负责保修。 3，仪器开机后，有 5 分钟左右的初始化时间，此时请不要进行其它操作。当环境温度过低时，初始化时间会增加。 4，将湿膜放在扫描平面上之前，请先 用吸水纸将大部分液体吸去，以避免扫描时液体从扫描平面与机器之间的缝隙流入机器内部。 5，扫描时，请不要打开仪器的上盖。 6，扫描完成以后，请在扫描平面上与膜 接触的位置滴上一些ddH2O，用无尘纸（KimberlyClark公司的Kimwipes）擦拭干净。 7，请避免频繁的开关机。 8，请不要在安装操作软件的电脑上安 装其它无关程序和上网，以保持系统的稳定。