1、利用微卫星 DNA 标记法进行 5 个肉用绵羊品种的多态性分析和杂种优势率预测张建新 1，岳文斌 1，张雨 1（1 山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801）摘要：研究选择了与产肉性能相关的 5 个微卫星标记，分析了这 5 个位点在杜泊、德国美利奴、特克塞尔、道塞特和右玉本地绵羊 5 个品种中的遗传多态性，通过遗传分析预测了 4 个国外引进肉用绵羊品种与右玉本地绵羊的杂种优势，并与实际测定结果进行了比较分析。结果表明，利用微卫星 DNA 多态性进行品种间杂种优势预测是可行的，杜泊羊与右玉本地绵羊杂交的杂种优势最大，与实际测定结果一致。关键词：羊；微卫星标记；遗传距离；杂种优势Stud
2、y on Polymorphism and Heterosis of five Meat sheep breeds using Microsatellite MarkerZHANG Jian-xing(ShanXi Agriculture University animal technology institute,ShanXi TaiGu,030801)Abstract:The study selected five microsatellite markers which related of the meat performance,to analysis the polymorphis
3、m in Doropor、Merino、Texel、Poll Dorset、Youyu local sheep ，forecast the heterosis of four introduced breeds and Youyu local sheep by the genetic analysis,and compare with the actual results.The result showed, it is feasible to forecast the heterosis of different sheep breeds by genetic polymorphism of
4、 microsatellite DNA,The heterosis is the largest in Doropor and Youyu local sheep,it accords with testing results on actual heterosis.Keywords:Sheep;Microsatellite marker;Genetic distance;Heterosis中图分类号：S813.3微卫星(microsatellite)是指以少数几个核苷酸(16个)为单位多次串联重复的DNA序列，亦称简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)，具有数
5、量大、分布广且均匀、多态信息含量高、检测快速方便等优点，被认为是各类遗传标记中最有价值的一种 1-3。微卫星DNA标记是近年继RFLP之后发展起来的一种新的分子遗传标记技术，以其所具有的优越性，已广泛应用于动物群体遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建，DNA指纹图的制作，功能收稿日期：2009-8 -7基金项目：山西省青年科学基金（2006021037）;山西省攻关项目“右玉绵羊杂种优势预测与配套系培育亲本优化组合研究” （20080311030-3） ；作者简介：张建新，男，博士，研究方向动物遗传育种与繁殖,Tel：13303469378; E-mail：.基因和QTL的定位，以及亲缘关系的鉴定
6、等多个方面，尤其是在分析群体遗传结构和遗传变异方面发挥着越来越重要的作用 4-7。现代杂种优势理论认为：杂种优势的大小在一定程度上取决于亲本间遗传差异的大小，即遗传距离 8。因此可以用微卫星标记法分析群体的遗传多态性，从而度量群体遗传变异来预测品种间杂种优势。雁门关生态畜牧经济区是我省重要的肉羊生产基地，肉用绵羊存栏数量较多，但良种覆盖率极低，生产效率极差。为了提高本地绵羊的生产效率 ，特引进国外著名肉用绵羊品种与其进行杂交。本研究采用微卫星标记法，对4个国外著名肉用绵羊品种与右玉本地绵羊品种进行遗传多样性评价，遗传结构分析，利用Nei氏遗传距离方法计算出绵羊品种间的遗传距离，并分析群体间遗传
7、距离的远近；开展杂交后代的杂种优势分析，从而在分子水平上标记辅助选择育种，为右玉本地绵羊品种的杂交改良奠定科学基础。1 材料与方法1.1 实验材料本实验在山西省右玉县宏宇牧业养殖场采集杜泊、德国美利奴、特克塞尔、道塞特、以及本地绵羊 5 个绵羊群体共 249 个个体的耳组织一小块（约 0.5g） ，放于装有 1ml70%乙醇的 1.5ml 的离心管中，冰壶保存，带回实验室，-70保存备用。实验室进行耳组织 DNA 提取和 PCR 扩增。1.2 实验方法1.2.1 耳组织 DNA 提取 STE、蛋白酶 K、SDS 过夜消化，酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提法。1.2.2 引物的选择 根据微
8、卫星选择标准，考虑到微卫星位点在染色体的位置、引物序列、组成特点、微卫星位点多态性及产物大小等，确定了与产肉性能相关的5个微卫星基因座BM3215、BMS1724、BMS460、CSSMO180V、BM3413，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列为：BM3215：5-TGCATCAACTAAGCCACACTG-3 ； 5-TTACACGCTGGTTTTCTGGG-3BMS1724：5-GACTTGCCCCAATCCTACTG-3 ； 5-ATTTCAGGTTTGTTGGTTCCC-3BMS460：5-TGCCCCATAGTGTAGTGCTC-3 ； 5-GCCAGCAGAGAATTGTAG
9、CA-3CSSM018OV：5-AGGAATTCCCTCTAGAAAAGCAGGC-3 ； 5-TGTGCATAATTTGTGTCCGTCCGGA-3BM3413：5-TCCCTGGTAACCAATGAATTC -3 ； 5-CAATGGATTTGACCCTCCC -31.2.3 PCR 反应条件微卫星BM3215扩增条件：反应总体积15l，双蒸水9.5l，10缓冲液1.5l，Mg 2+ 1.2l，dNTP 1.2l（0.22mmolL -1），引物0.3l（0.24mmolL -1），Taq酶0.2l（0.3U），DNA 2l。扩增程序为：95预变性4min；94变性30s，58.1退火30
10、s， 72延伸30s，33个循环。微卫星BMS1724扩增条件：反应总体积15l，双蒸水10.4l，10缓冲液1.5l(含Mg2+)， dNTP 1.3l（0.22mmolL -1），引物0.65l（0.24mmolL -1），Taq 酶0.15l（0.3U），DNA 1l。扩增程序为：95预变性4min；94变性30s，57.1退火30s，72延伸30s，33个循环。微卫星BMS460扩增条件：反应总体积15l，双蒸水9.5l，10缓冲液1.5l，Mg 2+ 1.2l，dNTP 1.2l（0.22mmolL -1），引物0.3l（0.24mmolL -1），Taq 酶 0.2l（0.3U），
11、DNA 2l。扩增程序为：95预变性4min；94变性30s，58.4退火30s， 72延伸30s，33个循环。微卫星CSSM018OV扩增条件：反应总体积15l，双蒸水10.5l，10缓冲液1.5l(含Mg2+)， dNTP 1.3 l（0.22mmolL -1），引物0.65l（0.24mmolL -1），Taq 酶 0.1 l（0.3U），DNA1l。扩增程序为：95预变性4min；94变性30s，58.6退火30s， 72延伸30s，35个循环。微卫星BMS3413扩增条件：反应总体积15l，双蒸水9.5l，10缓冲液1.5l，Mg 2+ 1.2l，dNTP 1.2 l（0.22mmo
12、lL -1），引物0.3 l（0.24mmolL -1），Taq 酶 0.2 l（0.3U），DNA2l。扩增程序为：95预变性4min；94变性30s，57.1退火30s， 72延伸30s，33个循环。1.2.4 PCR 扩增产物的电泳检测将扩增产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，再用银染法进行定影、显影。其银染过程如下：蒸馏水洗1次，将凝胶放入约500ml硝酸银染色液中，在格床上轻摇15-20min , 蒸馏水洗1次,先加100ml碳酸钠显色液轻摇15s,弃去显色液后再加400m1显色液,轻摇15min,即可看清楚条带。1.2.5 数据统计分析 等位基因片段的大小和频率通过凝胶成像系统分析获
13、得。用PopGen32软件计算每个基因座的有效等位基因数、杂合度、多态信息含量和群体间的遗传距离。1.2.6 绵羊各杂交组合杂交效果测定在相同的饲养条件下，分别测定以国外四个引进品种杜泊、特克塞尔、道塞特、德美及其与右玉本地绵羊杂交一代公羊（各 30 只）的初生重、1 月龄、3 月龄、6 月龄及周岁重。2 结果与分析21 绵羊微卫星标记DNA 多态性检测结果图1、2为两个位点在两个群体中的部分聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。微卫星遵循孟德尔定律，且呈共显性遗传。如果一个2倍体染色体相对位点的微卫星核心重复数相同，则该个体在该位点纯合基因型；重复数不同，碱基插入或缺失等其它原因表现为杂合型，反映在凝胶电
14、泳上则是纯合个体是1条带，杂合子则是2条带。2.2 微卫星基因座等位基因频率5 个微卫星基因座的等位基因分布及其频率分布见表（1-5） 。由表可见，在 BM3215 基因座共发现了 6 个等位基因，变异范围在 129167 之间，其中等位基因 167 仅见于道赛特羊中，右玉本地绵羊中没有发现等位基因 160；在 BMS460 基因座共发现了 6 个等位基因，变异范围在 125147 之间，其中 136 等位基因仅在德美和右玉本地绵羊中发现，杜泊和道赛特羊中没有发现等位基因147；在 BMS1724 基因座共发现了 6 个等位基因，变异范围在 147174 之间，其中等位基因 174 没有在杜泊
15、和道赛特羊中发现；在 CSSMO180V 基因座共发现了 5 个等位基因，变异范围在 120139之间，其中 129 等位基因仅在右玉本地绵羊中未发现，杜泊和道赛特羊中没有发现等位基因139；BM3413 基因座共发现了 7 个等位基因，变异范围在 170201 之间，其中等位基因 170 仅见于杜泊和道赛特羊中，等位基因 201 仅见于特克赛尔和德美羊中。实验结果表明，5 个微卫星基因座在 5 个绵羊品种中存在多态性，因此，可以用于绵羊遗传多样性的评估。图5 微卫星位点BMS1724的PCR 产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Fig.5 PAGE result of PCR product at B
16、M1724 图 6 微卫星位点 CSSMO180V的PCR 产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Fig.6 PAGE result of PCR product at MCMA26 2.3 微卫星基因座的多态信息含量、有效等位基因数及群体杂合度5 个微卫星基因座的多态信息含量、有效等位基因数及群体杂合度见表 6。由表可以看出，基因座 BM3215 的多态信息含量、有效等位基因数和群体杂合度最高，基因座 BMS460 的多态信息含量、有效等位基因数和群体杂合度相对较低，说明基因座 BM3215 的变异最大，而基因座 BMS460 的变异较小。从品种的角度来看，杜泊羊的各项指标最高，右玉本地绵羊的相对较低，
17、说明杜泊羊的遗传变异较大，而右玉本地绵羊的遗传变异较小。2.4 品种间的遗传距离5 个绵羊品种间的遗传距离见表 7。由表可以看出，杜泊与右玉本地绵羊的遗传距离最大，其次为特克赛尔、德美、道赛特，杜泊与道赛特的遗传距离最小。品种间的遗传距离可以反映它们亲缘关系的远近。遗传距离越大，二者的亲缘关系就越远，杂交后的杂种优势就会越大，由此可以预测，杜泊与右玉本地绵羊杂交后的杂种优势M最大。杜泊绵羊原产于南非，是有角陶赛特与波斯黑头羊杂交培育而成的肉绵羊品种，所以二者遗传距离小，符合它们的育成史。2.5 4 个引进品种与右玉本地绵羊杂交一代生产性能及杂种优势的比较4 个引进绵羊品种与右玉本地绵羊杂交一代
18、初生重、1 月龄重、3 月龄重、6 月龄重、周岁重及杂种优势率见表 8.由表可以看出，杜泊羊与右玉本地绵羊杂一代的体重和杂种优势率最高。与利用微卫星标记技术预测的杂种优势结果一致。3 讨论5 个微卫星基因座在 5 个绵羊群体中均存在多态性。根据微卫星选择的标准，每个微卫星要有 4 个等位基因方可较好的用于遗传多样性评估。实验结果得知，BM3215 基因座有 6 个等位基因，BMS460 基因座有 6 个等位基因，BMS1724 基因座有 6 个等位基因，CSSMO180V 有 5 个等位基因，BM3413 有 7个等位基因。所以以上 5 个微卫星基因座均可以用于绵羊遗传多样性的评估。由于本文所
19、用的绵羊品种和微卫星基因座较少，对绵羊品种间遗传关系的准确评估还有待进一步研究。多态信息含量（PIC）和杂合度（H）反映群体内的遗传变异程度，数值高说明遗传变异大，反之则群体内的遗传变异小。试验结果表明，5 个微卫星基因座在 5 个绵羊群体中均表现高度多态（PIC0.5）杜泊羊的群体多态信息含量和杂合度最高，右玉本地绵羊的较低，表明杜泊羊的遗传变异程度最大，这说明不同的品种由于遗传背景、来源不同，变异程度也不同。杜泊羊是有角陶赛特与波斯黑头羊杂交培育而成的肉用绵羊品种，有着丰富的遗传基础，因而变异程度较高，而右玉本地绵羊是中国的一个地方优良品种，是经过长期的本品种选育形成，引进的外血较少，因而
20、变异程度较小。一般来说，分布地区距离较远，来源差别较大的品种，可以获得较大的杂种优势。从试验结果看，杜泊羊与右玉本地绵羊的杂种优势最大。杜泊绵羊是利用英国有角陶赛特与波斯黑头羊杂交培育而成的肉用绵羊品种，前胸丰满，后躯肌肉发达，生长迅速，而右玉本地绵羊生长速度较慢，产肉性能差，因而二者有较高的杂种优势。本研究通过实际测定杜泊、德美、特克赛尔、道赛特羊与右玉本地绵羊的杂交效果与理论预测的杂种优势进行比较，得出同样的结果，说明利用微卫星 DNA 多态性预测绵羊品种间的杂种优势是可行的。传统的品种间杂种优势测定一般都要通过杂交试验完成，即费时又费力，而利用微卫星 DNA 多态性预测杂种优势即快速又节
21、省成本，对今后引进肉羊在中国的合理利用及绵羊育种工都具有重要的应用价值。4 结论4.1 5 个微卫星基因座（BM3215、BMS460、BMS1724、CSSMO180V、BM3413）在 5 个绵羊品种（杜泊、特克赛尔、德美、道赛特、右玉本地绵羊）中存在多态性，因此，可以用于绵羊遗传多样性的评估。4.2 通过不同品种间遗传距离分析，在引进的 4 个绵羊品种中，与右玉本地绵羊的杂种优势由大到小依次为杜泊、道赛特、特克赛尔、德美，与实际杂种优势的测定结果相符合，说明利用微卫星 DNA 多态性预测绵羊品种间杂种优势是准确可行。表 1 微卫星基因座 BM3215 等位基因分布及频率Table 1 A
22、llelesndistribution and frequencies of microsatellite loci BM3215等位基因 Alleles品种Breeds 129 136 140 145 160 167杜泊 Doropor 0.1071 0.3393 0.1786 0.25 0.125 0特克塞尔 Texel 0.2679 0.2857 0 0.4107 0.0357 0德美 Merino 0.375 0.375 0.1071 0.1071 0.0357 0本地绵羊 Youyu local sheep 0.375 0.25 0.2321 0.1429 0 0道塞特 Dorset
23、 0.0536 0.3393 0.3214 0.1786 0.0536 0.0536表 2 微卫星基因座 BMS460 等位基因分布及频率Table 2 Allelesndistribution and frequencies of microsatellite loci BMS460等位基因 Alleles品种125 129 136 140 143 147杜泊Doropor0.2679 0.2857 0 0.4107 0.0357 0特克塞尔 0.0312 0.2656 0 0.4375 0.2031 0.0625德美 0.0645 0.2419 0.0161 0.4194 0.1452 0
24、.1129本地绵羊 0.1207 0.2586 0.0517 0.2586 0.1724 0.1379道塞特 0.2241 0.2759 0 0.4483 0.0517 0表 3 微卫星基因座 BMS1724 等位基因分布及频率Table 3 Allelesndistribution and frequencies of microsatellite loci BMS1724等位基因品种147 156 160 165 170 174杜泊Doropor0.375 0.375 0.1071 0.1071 0.0357 0特克塞尔TexeTexel0.375 0.2344 0.1406 0.0938
25、 0.1406 0.0156德美 0.3548 0.2419 0.1613 0.0645 0.129 0.0484本地绵羊 0.3621 0.3276 0.0862 0.1034 0.0517 0.069道塞特 0.3448 0.2414 0.1724 0.1897 0.0517 0表 4 微卫星基因座 CSSMO180V 等位基因分布及频率Table 4 Allelesndistribution and frequencies of microsatellite loci CSSMO180V等位基因品种120 124 129 133 139杜泊 Doropor 0.375 0.25 0.23
26、21 0.1429 0特克塞尔 0.2344 0.4531 0.0938 0.1562 0.0625德美 0.2258 0.3871 0.0968 0.2097 0.0806本地绵羊 0.2759 0.3793 0 0.1552 0.1897道塞特 0.2759 0.3276 0.2241 0.1724 0表 5 微卫星基因座 BM3413 等位基因分布及频率Table 5 Allelesndistribution and frequencies of microsatellite loci BM3413等位基因品种170 176 180 184 190 195 201杜泊Doropor0.0
27、536 0.3393 0.3214 0.1786 0.0536 0.0536 0特克塞尔 0 0.3906 0.2344 0.0625 0.125 0.0469 0.1406德美 0 0.4032 0.2419 0.0484 0.0806 0.1129 0.1129本地绵羊 0 0.431 0.3621 0.069 0.069 0.069 0道塞特 0.0345 0.4138 0.2759 0.1379 0.0862 0.0517 0表 6 5 个微卫星基因座在各品种中的多态信息含量（PIC） 、有效等位基因数（E）及群体杂合度（H）Table 6 Polymorphism informati
28、on content,the number of effective alleles and heterozygosity of five microsatellite loci in each breeds品种 Breeds基因座Loci 杜泊 特克赛尔 德美 本地绵羊 道赛特 平均BM3215 PIC 0.7660 0.6832 0.6549 0.7259 0.7358 0.7132E 4.8613 3.7372 3.4139 4.2264 4.3916 4.1261H 0.6517 0.6625 0.6161 0.6357 0.6172 0.6366BMS460 PIC 0.7708 0
29、.6403 0.6880 0.6124 0.6698 0.6763E 5.0060 3.2456 3.6679 3.0927 3.0306 3.6086H 0.6207 0.5625 0.6452 0.6071 0.5517 0.5974BMS1724 PIC 0.6952 0.7200 0.7321 0.6409 0.7139 0.7004E 3.7883 4.0960 4.2806 3.2735 4.0726 3.9026H 0.5862 0.6562 0.5806 0.5357 0.4483 0.5614CSSMO180V PIC 0.6699 0.6601 0.6985 0.6726
30、0.6880 0.6778E 3.5711 3.3629 3.8363 3.6046 3.7968 3.6343H 0.5862 0.7188 0.6774 0.7500 0.6897 0.6844BM3413 PIC 0.6110 0.7159 0.7095 0.6990 0.6808 0.6832E 3.0197 4.0157 3.9145 3.8621 3.6017 3.6827H 0.7241 0.6250 0.6129 0.6429 0.5862 0.6382平均 Mean PIC 0.7026 0.6839 0.6908 0.6702 0.6977 0.6890E 4.0493 3
31、.6915 3.8226 3.6119 3.7787 379080.6036H 0.6138 0.6250 0.6065 0.6143 0.5586表 7 5 个品种间的遗传距离Table 7 Genetic distances among five breeds品种Breed杜泊 特克赛尔 德美 本地绵羊 道赛特杜泊特克赛尔 0.1166德美 0.1120 0.0237本地绵羊 0.1620 0.1548 0.1532道赛特 0.0119 0.0778 0.0823 0.1529表 8 杂种一代绵羊初生重、1 月龄、3 月龄、6 月龄、周岁重及杂种优Table 8 The Birth wei
32、ght, daily gain and heterosis rate at one-,three-and six-month-old of age in first filial性状 杂交组合 杜泊本地 特克赛尔本地 德美本地 道赛特本地初生重 一代杂种平均值（） 4.26 3.81 3.76 4.03双亲平均（） 3.81 3.48 3.44 3.65杂种优势率（%） 11.11 9.48 9.30 10.411 月龄重 一代杂种平均值（） 13.79 11.42 11.26 12.23双亲平均（） 1221 10.31 10.29 10.93杂种优势率（%） 12.94 10.77 9.4
33、3 11.893 月龄重 一代杂种平均值（） 24.98 19.67 18.56 23.67双亲平均（） 21.74 17.54 16.61 21.04杂种优势率（%） 14.90 12.14 11.74 12.506 月龄重 一代杂种平均值（） 41.67 32.94 31.75 39.65双亲平均（） 36.23 28.97 28.14 34.57杂种优势率（%） 15.02 13.70 12.83 14.69周岁重 一代杂种平均值（） 70.76 63.78 63.59 68.79双亲平均（） 60.92 55.64 56.05 59.71杂种优势率（%） 16.15 14.63 13.
34、45 15.21参考文献1 Baumung R, Cubric-Curik V, Schwend K, Achmann R, Slkner J. Genetic characterisation and breed assignment in Austrian sheep breeds using microsatellite marker informationJ.Anim Breed Genet,2006,Aug;123(4):265-271.2 Kim TH, Kim KS, Choi BH, Yoon DH, Jang GW, Lee KT, Chung HY, Lee HY, Par
35、k HS, Lee JW. Genetic structure of pig breeds from Korea and China using microsatellite loci analysisJ. Anim Sci, 2005,Oct;83(10):2255-2263.3 Fang M, Hu X, Jiang T, Braunschweig M, Hu L, Du Z, Feng J, Zhang Q, Wu C, Li N. The phylogeny of Chinese indigenous pig breeds inferred from microsatellite ma
36、rkersJ. Anim Genet,2005, Feb;36(1):7-13.4 Zhang GX, Wang ZG, Chen WS, Wu CX, Han X, Chang H, Zan LS . Genetic diversity and population structure of indigenous yellow cattle breeds of China using 30 microsatellite markersJ. Anim Genet,2007,Dec;38(6):550-559.5 Wang JZ, Chu MX, Wang AG, Li N, Fu JL, Xi
37、e F, Chen GH. Genetic relationships among seven sheep populations using four microsatellite markersJ.Yi Chuan,2004,Sep;26(5):637-643.6 Jia B, Chen J, Zhao RQ, Luo QJ, Yan GQ, Chen J. Microsatellite analysis of genetic diversity and phylogenetic relationship of eight sheep breeds in XinjiangJ.Yi Chua
38、n Xue Bao,2003 Sep; 30(9): 847-854.7 Qu L, Li X, Xu G, Chen K, Yang H, Zhang L, Wu G, Hou Z, Xu G, Yang N. Evaluation of genetic diversity in Chinese indigenous chicken breeds using microsatellite markersJ.Sci China C Life Sci,2006,Aug;49(4):332-341.8 李俊杰，桑润滋，贾青等.畜禽杂种优势估测方法的研究进展J.黄牛杂志，2001，27（1）：47.文章修改内容（1） 中文摘要中去掉“本研究“这样的表述，检查并对英文摘要进行了修改。（2） 补充了中图分类号，并重新撰写了作者简介。（3） 重新撰写了前言。（4） 针对写该意见中专家所提的杂交效果测定进行说明：研究中所用的国外引进品种与右玉羊杂一代羊是通过人工受精的方法得到的杂一代，是采集国外引进品种羊的精液对右玉本地绵羊受精后产生的。（5） 添加了两个微卫星基因座的PCR多态性结果的电泳结果图。（6）修改了文中的表格格式。
