1、21世纪生命科学发展的重要态势,第七章 蛋白质工程的应用,抗原（antigen,Ag)是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性结合的物质 。 最常见的抗原分子是大分子蛋白质。,第一节 抗体工程,医学上重要的抗原,病原微生物：细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次体、放线菌、螺旋体、真菌。成分复杂，不同抗原成分组成的复合体。 细菌外毒素与类毒素 外毒素：某些细菌在生长过程中合成分泌到菌体外的毒性物质。肉毒毒素 1mg 可杀死 2亿只小鼠。 类毒素：外毒素经 0.30.4甲醛溶液处理后，失去毒性，仍保留免疫原性。 异种动物血清：抗毒素的抗体，可中和病人体内
2、相应毒素，同时是异种抗原。 肿瘤抗原：细胞恶变过程中出现的新抗原的总称。,抗体的发现,1890 年，德国学者 Emil von Behring在 Koch 研究所应用白喉外毒素给动物免疫，发现在其血清中有一种能中和外毒素的物质，称为抗毒素。将这种免疫血清转移给正常动物也有中和外毒素的作用。这种被动免疫法很快应用于临床治疗。Behring于 1891 年应用来自动物的免疫血清成功治疗了一个白喉患者，这是第一个被动免疫治疗的病例。为此，他于 1902 年获得了诺贝尔医学奖。,Emil von Behring 1854 - 1917, Nobel Prize in 1902 for demonstr
3、ating that circulating antitoxins against diphtheria and tetanus toxins conferred immunity.,Emil von Behring倍林 德国细菌学、免疫学家。以抗毒素对白喉患者进行治疗,发现此种中和毒素的能力能被动地转移给正常动物,使后者获得抗白喉毒素的免疫力, 开创了血清疗法，使白喉死亡率大为降低；他还证明用非致死量的破伤风毒素多次给动物注射后，其血清对破伤风毒素有特异性中和作用，将此血清注射给其他动物也可使之获得免疫，又研制成功破伤风免疫血清，用于战伤获得良好效果。,第一节 抗体工程,一、概述 抗体（An
4、tibody ，Ab): 是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig): 是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。IgG、IgM、IgA、和IgE,抗体工程（antibody engineering）是通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体蛋白序列进行改造，改善抗体某些功能的技术。,二、抗体的结构与分类,（一）抗体的结构,1重链和轻链重链（heavy chain，H链）由450-550个氨基酸组成，分子质量约为50-70 ku，有4-5对链内二硫键。轻链（
5、light chain，L链）由214个氨基酸组成，分子质量约为2.5 ku，有两对链内二硫键。,2可变区和恒定区,抗体分子结构示意图,抗体分子的酶解片段,（1）可变区（variable region，V区）重链可变区（VH区）为重链N端约110个氨基酸残基组成的区域，轻链可变区（VL区）位于轻链N端约100个氨基酸残基区域。（2）恒定区（constant region，C区）氨基酸序列相对稳定保守的区域。重链C区（CH区）位于重链C端340-440个氨基酸组成的区域，轻链C区（CL区）位于轻链C端约105个氨基酸的区域。,（二）抗体的分类,多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体,1.多克隆抗体(p
6、olyclonal antibody, pAb),6-8aa,用含多种抗原决定簇的Ag物质免疫动物，刺激多个B细胞克隆所获得的免疫血清（含多种Ab的混合物），称为pAb。特点：来源广泛，制备容易； 特异性不高。,2.单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb, mAb),由一个识别一种Ag表位的B细胞克隆产生的同源Ab。 借助小鼠B细胞杂交瘤（hybridoma）技术，所制备的高度均一（属同一类、亚类、型别）、单一特异性（仅针对特定抗定Ag表位）的Ab。特点：纯度高,特异性强,效价高,可大量生产，交叉反应少或无。,杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特
7、征。当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。B淋巴细胞杂交瘤技术 该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。前者的主要特征是它的抗体分泌功能，但在体外不能长期生长；而后者则可在体外培养无限分裂增殖，二者杂交融合，形成在体外无限增殖分裂并产生McAb的杂交瘤细胞。,单 克 隆 抗 体 的 基 本 原 理,细胞融合,细胞融合（Cell fusion）是上世纪60年代发展起来的一门细胞工程技术，在自然条件下或人工诱导使两个或两个以上的相同或不同的细胞合并形成一个细胞的过程。细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞挨近，两者细胞膜粘合，以后膜组织局部破损，最终形
8、成完整的连续胞膜。,融合剂,细胞虽在体外培养条件下会自发融合，但频率极低，故均须添加具有诱导细胞融合效应的生物因子或化学试剂，或采用电融合技术，人为地促进细胞融合。通常把这种可以促进细胞融合，提高细胞融合率而加入的生物因子或化学试剂叫做细胞融合剂。,诱导细胞融合方法,生物方法（如灭活仙台病毒）：这种病毒可进入细胞内，在邻近的细胞之间形成细胞质桥，介导细胞与细胞的融合。,化学方法（聚乙二醇）：聚乙二醇简便、易得，且融合效果稳定，使细胞膜的脂类分子的酰键及极性基团发生重排，从而打开细胞膜促使细胞融合。（实验常用方法）,物理方法（电激和激光）：造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的
9、有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。,脾细胞,骨髓瘤细胞,50%PEG1mL,培养液10 mL,500g离心 10min,37 摇动、由慢渐快1min、静止1.5min,1000g离心 7min,加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内,HAT选择杂交瘤细胞,细胞融合是一个随机的物理过程，并非全部的细胞都能融合。除不同亲本细胞间的融合外，与此同时还伴有各亲本细胞的自身融合，就需设法把含两亲本细胞染色体的杂种细胞分离或筛选出来。最简便的办法无疑是应用选择培养基，使亲本细胞死亡，仅让杂种细胞存活下来。,HAT培养基： H (Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A (Aminopte
10、rin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T (Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA,HAT选择培养原理,随机融合后的细胞类型,HGPRT:黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,抗体的检测,细胞融合2周左右就可筛选杂交瘤细胞，即是有针对性地从众多的细胞孔中选出分泌所需抗体的杂交瘤孔。,3.基因工程抗体,基因工程抗体是利用DNA重组技术，通过对抗体基因结构与功能的了解,有目的地在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接、或修饰，或直接合成抗体基因序列，再将基因导入细胞表达产生的一类抗体。,基因工程抗体的类型,1. 人鼠嵌合抗体 2. 鼠单抗可变区人源
11、化抗体 3. 小分子抗体(Fab, Fv ,scFv，diabody，single domain antibody) ，minimal recognition unit) 4. 双特异性及多特异性抗体,人鼠嵌合抗体,在基因水平上将鼠源单克隆抗体的可变区和人抗体的恒定区连接起来，并在合适的宿主细胞中进行表达的抗体。,鼠单抗可变区人源化抗体,改形抗体将人单抗的CDR区替换成鼠单抗的相应区域，就能使得人单抗获得与鼠单抗一样的抗原特异性，并最大程度的降低抗体异源性。镶面抗体使骨架区中暴露的氨基酸残基替换成人单抗可变区的相应的氨基酸残基就可使鼠单抗可变区人源化。,小分子抗体的种类及组成,C,L,V,L,
12、V,H,C,H,1,V,L,C,L,V,H,C,H,1,C,H,2,C,H,2,C,H,3,C,H,3,单链抗体(scFv)是其中研究的最热门的领域之一,Hinge,(Fab)2,Fab,Fc,Membrane Extension,Antibody IgG structure,Antibody IgG structure,C,L,C,H1,Fv,Fv,scFv,Single Chain Fragment variable,ScFv的结构 特点,ScFv是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段, 由重链可变区和轻链可变区构成的小分子,它仍然保持着天然抗体的特异性和大致相似亲和力。重链可变区和轻
13、链可变区由一条亲水性的柔软的连接肽。从而形成和天然抗体中抗原结合位点相似的结构。,scFv 的特点,1. 分子小:全抗体的1/6 2. 免疫原性低 3. 非靶向组织中滞留时间短 4. 在血液中清除快 5. 对肿瘤穿透力强 6. 易于生产,1.疾病诊断,(1) ELISA诊断试剂盒：scFv与碱性磷酸酶或荧光素酶融合，做成ELISA试剂盒。这种试剂盒更简便, 节省测试时间。(2) 免疫成像诊断:用同位素标记的抗肿瘤相关抗原的scFv应用于病人的显像诊断。肿瘤部位定位明显，优于目前应用的各种成像技术。,scFv的应用,2.疾病治疗,肿瘤治疗: scFv 用于肿瘤治疗主要通过以下方式: (1) 重组
14、免疫毒素:将scFv 基因与毒素基因相连，经表达后得到的单链抗体与毒素的融合蛋白； (2) scFv 与细胞因子融合蛋白； (3) scFv 与药物代谢酶相连：称为“抗体导向酶-前体药物疗法”(ADEPT),Prion（疯牛病）,ScFv在朊病毒检测上的应用,Prion是引起人和动物的一种传染性病原，又称疯牛病、羊瘙痒病、人类海绵状脑病。迄今尚无有效的治疗方法。两种Prion：PRPc 和PRPsc,三、抗体融合蛋白,将抗体分子（或片段）与其他效应分子连接，可以产生具有新生物学活性的杂合分子（hybrid molecule），即免疫导向分子。借助于抗体对靶抗原的高度特异性，可将连接的融和蛋白的
15、生物学活性导向至特定的靶部位，更有效地发挥其生物学功能，减轻对非靶部位组织的毒副作用。,（一）免疫毒素,免疫毒素（Immunotoxions，ITs）是运用蛋白质工程技术设计、构建，将一种毒素肽与对靶细胞具有高度特异性抗体连接起来的融合蛋白。免疫毒素通过抗体部分靶向结构域的特异结合功能使毒素传递到靶细胞并与之作用进而杀死靶细胞。,1毒素2重组抗体片段3几类重组免疫毒素,1毒素,植物毒素的A链或植物RIP通常具有N-糖苷酶的活性，可催化核糖体组成成分28S RNA的特定位点脱嘌呤，从而使核糖体60S亚基失活。理论上，一个A链分子或RIP每分钟可以使1500个核糖体失活，从而抑制蛋白质合成，最终导
16、致细胞死亡。真菌毒素均有特异的核酸内切酶活性，可以催化水解28S RNA 3端的单个磷酸酯键，导致核糖体60S亚基失活，抑制蛋白质合成，从而导致细胞死亡。,2重组抗体片段,有研究者构建了源于mAb B3的二硫键稳定单链抗体（B3 dsscFv），与改造后的假单孢菌外毒素PE-38基因进行了融合表达，所获得的B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性，为研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物奠定了一定的基础。,3几类重组免疫毒素,研究者构建了二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体（hdsFv）与牛蛙核糖核酸酶（RC-RNase）重组免疫毒素（hdsFv-RC-RNase）
17、，研究表明hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素对荷人肝癌裸鼠移植瘤生长具有良好的抑制作用。,3几类重组免疫毒素,处于实验室研究及临床试验阶段的几种重组免疫毒素,（二）基因工程抗体-酶融合蛋白,1ADEPT体系中的抗体 用于ADEPT体系的理想抗体应满足以下几方面： 抗体与肿瘤组织亲和力较高； 抗体不结合正常组织或结合很弱； 抗体与抗原的结合不受酶结合的影响； 抗体与酶结合不影响酶的活性； 抗体的免疫原性较低等。,2ADEPT体系中的酶,3几类ADEPT体系,（三）基因工程抗体-细胞因子融合蛋白,细胞因子（cytokines）主要介导和调节免疫应答和炎症反应，因此对大部分免疫细胞，如单核细胞
18、、巨噬细胞、T细胞和B细胞等均有刺激作用。细胞因子治疗可以使某些没有免疫原性的肿瘤产生免疫原性，激活保护性免疫反应。然而由于这种免疫反应是非特异的，常产生全身毒性，导致严重的毒副作用。,Deng等(2003)将抗HER2-scFv、人IgG1的Fc段和IL-2基因片段连接，并在CHO细胞中成功表达。,该融合蛋白能与肿瘤细胞表面HER2胞外区特异性结合介导ADCC作用，具有IL-2的生物学活性，增强抗肿瘤效应。有研究者构建的融合蛋白有2个抗原结合位点，一个可与肿瘤细胞HER2胞外区特异性结合，另一个可与NK细胞、吞噬细胞、中性粒细胞表面的CD16(FcR)特异性结合。,研究者将抗卵巢癌单链抗体1
19、83B2scFv与细胞因子IL-2构建成抗卵巢癌单链免疫细胞因子IL-2/183B2scFv，并在CHO细胞内表达出可溶性融合蛋白。,四、抗体的应用,抗体在生物医药方面有着广泛的应用，在疾病的诊断、疾病的治疗、器官移植等方面发挥着越来越重要的作用。,（一）疾病的诊断,抗体的放射免疫显影抗体经过适宜的放射性核素标记，静脉或者腹腔、腰椎穿刺等方式进入体内后，特异的作用于靶组织细胞上的抗原，可以显示出特异的抗原分子及细胞组织的机能状态。,（一）疾病的诊断,1肿瘤显像中的应用2心血管系统疾病中的应用3炎症显像中的应用,肿瘤显像中的应用,结肠-直肠癌或卵巢癌显像（99mTc标记的IMMU-4）小细胞肺癌
20、显像（NR-LU-10）肝癌单克隆抗体(131I标记的HAb18Fab）,心血管系统疾病中的应用,99mTc标记的抗平滑肌及球蛋白单抗（SM-MAb）注入主动脉断裂小鼠体内，显像结果显示放射性活性在断裂处明显增加。,炎症显像中的应用,99mTc标记的抗CD15IgM的单克隆抗体对阑尾炎的显像。时间短，显像质量高，诊断快.,（二）疾病的治疗,1基于抗体的放射免疫治疗放射免疫治疗（radio immune therapy，RIT）指利用特异性抗体作为运载工具，偶联上发射或粒子的放射性核素，将射线定向引导到肿瘤部位，对瘤体进行内照射治疗。,2抗体药物,（1）肿瘤相关抗体药物（2）心血管疾病相关的抗体
21、药物（3）抗病毒抗体药物,（1）肿瘤相关抗体药物,抗肿瘤单抗药物一般可分为两类： 一类是纯粹的单克隆抗体，它们通过封闭与肿瘤细胞生长代谢相关的细胞因子、信号通路或通过抗体介导免疫系统杀伤肿瘤细胞，从而起到抗肿瘤作用。另一类是单抗与抗肿瘤药物的免疫偶联物，是抗肿瘤药物的主要研究方向。,已被美国FDA批准上市的肿瘤治疗性抗体,（2）心血管疾病相关的抗体药物,以阿昔单抗（abcixiab）为代表的单克隆抗体药物，在多种心血管疾病的治疗上取得了显著疗效。 7E3（商品名为ReoPro abcixiab）是抗GPIIb-IIIa的单克隆抗体。7E3只要阻断约80%的GPIIb-IIIa位点，就能完全抑制
22、血小板的聚集反应。,（3）抗病毒抗体药物,2002年底至2003年严重急性呼吸综合症(SARS)的全球性暴发造成了约8000人感染，774人死亡。引起SARS的病原体，SARS冠状病毒(SARS-CoV)是一种新型冠状病毒，人群基本上无免疫力。 SARS-CoV抗体工程的研究，是探索病毒的检测、病毒在人体中的分布、疾病的预防及治疗的基础。,Vero E6 Cell CPE,SARS病毒的电镜图片,Genome structure of SARS-CoV,N: 与病毒RNA结合形成核衣壳,诱导细胞免疫 M:决定病毒出芽位点,诱导Alfa干扰素的生成 E:病毒颗粒的装配,可能与诱导宿主细胞调亡有关
23、 S:诱导病毒包膜与宿主细胞膜的融合,非结构蛋白nsp14,（三）抗体在其他方面的应用,1在器官移植方面的应用,抗体在器官移植方面的主要研究成果,2在免疫戒毒疗法中的应用,该方法是将滥用药物如可卡因作半抗原免疫动物，诱导机体产生针对滥用药物的抗体，在外周血中中和药物，减少或阻断滥用药物通过血脑屏障进入中枢神经系统，间隔一段时间加强免疫，可保证机体体液中保持高滴度的抗体，从而中和吸入的毒品，阻断其进入大脑，使吸毒患者无法产生欣快感，从而达到防止复吸的目的（Bunce CJ et al 2003）。,第二节 酶的蛋白质工程,酶的蛋白质工程是指根据蛋白质的结构规律及其与功能的关系，对蛋白质进行改造，
24、以生产出性能更加优良、更能满足人类社会需要的新型酶分子。,一、枯草杆菌蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成，因此该酶具有重要的应用价值，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。,（一）结构及生物学特性,枯草杆菌蛋白酶（Subtilisin，EC 3.4.21.62）是由枯草芽孢杆菌属细菌（Bacillus subtilis）所分泌的胞外碱性蛋白酶，属丝氨酸蛋白水解酶类。枯草杆菌蛋白酶依其来源不同分为Carlsberg、BPN、E、BL、YaB等多种。对于枯草杆菌蛋白酶结构与功能的研究已有较长的历史，其三维结构都基本研究清楚。大部分枯草杆菌蛋白酶是由270多个
25、氨基酸残基组成。,（二）蛋白质工程改造,1增强抗氧化性,野生型与单点突变枯草杆菌蛋白酶比活的比较*,2改变底物特异性3提高酶的热稳定性4改良酶的pH活性范围5提高酶在有机相中的反应效率,二、木糖异构酶,木糖异构酶（D-Xylose Isomerase，EC 5.3.1.5）又称葡萄糖异构酶（Glucose Isomerase，GI），是工业上大规模制备高果糖浆的关键酶，也是国际上公认的研究酶催化机制及建立蛋白质工程技术最好的模型之一。,（一）结构及特性,木糖异构酶分子是一个四聚体，由四个相同的分子质量为45 kDa的亚基形成两个二聚体。亚基的结构单体间的交接面的大小是二聚体间的交接面的三倍，因
26、此两个二聚体间的作用相对欠稳定。该酶的稳定性及活性受金属离子影响，Mg2+、Co2+及Mn2+对该酶有激活作用，而Ca2+、Hg2+及Cu2+起抑制作用。,（二）蛋白质工程改造,耐热性的改进底物亲和性的改善最适反应温度的改变酶活及最适pH的改变,1.耐热性的改进,（1）定点突变 （2）Gly及表面疏水性氨基酸置换 （3）二聚体交接面的改造,Streptomyces olivaceoviridis 木糖异构酶定点突变位置图 (http:/swissmodel.expasy.org),木糖异构酶二聚体交接面赖氨酸位置 (http:/swissmodel.expasy.org),C. thermos
27、ul furogenes木糖异构酶Trp139/Val186点突变对底物亲和性的影响*,2底物亲和性的改善,3最适反应温度的改变,将两个氨基酸残基Pro137和Asp247突变成Gly，获得了三个突变体P137G、D247G及P137G和D247G的双突变体，并构建表达载体，转化酿酒酵母H158。酶活性分析显示，三个突变体在中温条件下的酶活性均有所提高，特别是30的酶活提高了1倍； 酶的最适pH范围有很大的拓展，在pH6.0-9.0之间都能表现出很高的酶活性。,4酶活及最适pH的改变,如锈赤链霉菌的D56N和E221A突变体，当pH从8.5-8.8降至6-7.5时酶活性提高40,三、植酸酶,植
28、酸酶（Phytase，EC.3.1.3.8）是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。植酸酶制剂对于提高植物性饲料中磷的利用率，减轻畜禽高磷排泄物对环境的污染以及饲料中矿物质的吸收利用具有重要作用。,（一）特性,推广应用中存在热稳定性差的问题熔点在56-63之间加工饲料的制粒过程需要一个短暂的高温过程，温度一般在75-93饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性,（二）蛋白质工程改造,1.提高热稳定性2.改良最适pH3.提高比活性4.其他方面,（1）定点突变 （2）一致性技术的应用 （3）二级结构的改造 （4）酶结构的延伸,提高热稳定性,Aspergillus fumigat
29、us1植酸酶定点突变位置示意图 (http:/swissmodel.expasy.org),四、溶菌酶,（一）结构及特性溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）又称胞壁质酶（Muramidase），是糖苷水解酶，作用于N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）及N-乙酰胞壁酸（NAM）之间的-1，4糖苷键，能使某些细菌细胞壁中的黏多糖成分水解，因而具有溶菌能力。鸡卵清溶菌酶是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链，有四对二硫键，分子量为14.4 kDa。,溶菌酶活性中心示意图(http:/swissmodel.expasy.org),（二）蛋白质工程改造,1抗菌范围的扩大2热稳定性的提高（1）加强
30、疏水中心（2）引进糖链,溶菌酶 的三级结构,五、其他酶,1. 扩展青霉碱性脂肪酶2戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶3乙酰胆碱酯酶,第三节 抗体酶,抗体酶（abzyme）又称催化性抗体（catalytic antibody），是一类具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性，它既具有抗体的高度选择性，又具有酶的高效催化效率。,一、抗体酶的作用机理,抗体酶和所有的抗体一样，都是由两条轻链和两条重链构成，抗原与轻链和重链的可变区特异性结合，因此可变区的氨基酸排列顺序决定了抗体分子的特异性。,1酰基转移反应,氨基酸在掺入肽链之前必须进行活化以获得额外的能量，这一活化过程即是酰基转移反应。,2重排反
31、应,Claisen重排是有机化合物异构化的一种重要形式，生物体内一些化合物在光照下会发生Claisen重排。,3光诱导反应,光诱导反应包括光聚合反应和光裂解反应。这两类反应在植物体内是非常重要的。DNA的修复也涉及到光诱导反应。,4水解反应,抗体酶主要催化生物体内两类水解反应，即酰胺水解和酯水解。对蛋白质而言，蛋白质的水解都属于酰胺水解。 磷酸酯键是自然界最稳定的化学键之一，其水解是对抗体酶的挑战。Janda等利用稳定的五配位氧代铼络合物A模拟RNA水解时形成的环形氧代正膦中间物，产生了一种单抗G12，可以催化水解磷酸二酯键。,5氧化还原反应,Shokat制得了对氧化态黄素Km=8mmol/L
32、，对还原态Km=300 nmol/L的抗体，使标准电位差变为-342 mV，由此，黄素还原态的还原范围相应扩大，一些原来无法按其还原的物质（即标准还原电位差大于抗体酶催化的黄素标准还原电位差）得以还原。因此抗体酶可以使热力学上原来无法进行的氧还反应得以进行。,6金属螯合反应,金属螯合反应对于辅酶、辅因子和酶的结合具有重要的意义。,二、抗体酶的制备,抗体酶的设计和制备方法主要有： 诱导法 拷贝法 引入法 化学修饰法 基因工程法,（一）诱导法,1诱导和转换设计 2反应免疫法,诱导法制备抗体酶,（二）拷贝法,（三）引入法,引入法就是借助基因工程和蛋白质工程方法将催化基因引入到已有底物结合能力的抗体的
33、抗原结合位点上。 具体来说，可以采用寡核苷酸定点诱变技术将特定的氨基酸残基引入抗原结合部位使其获得催化功能，也可以采用选择性化学修饰的方法将人工合成的或天然存在的催化基因引入到抗原结合部位。,（四）化学修饰法,将人工合成的或天然存在的催化基团引入到抗体的抗原结合部位来获得抗体酶的方法就是化学修饰法。 亲和标记也是一种有效方法 。,（五）抗体库法,抗体库法即用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片断，从中筛选特异性的可变区基因。,（六）抗独特型抗体酶,根据Jerne提出的免疫网络学说，抗体可变区不仅显示出抗体活性，而且由于有独特型的抗原决定簇，又显示出抗原活性。 优点是可直接利用酶诱导机体产生抗体，进而产生与酶具有相同活性部位的抗独特型抗体。,三、抗体酶的应用,（一）理论研究中的应用 （二）有机合成中关键反应的催化 （三）手性药物合成及拆分 （四）在前药设计中的应用 （五）临床治疗中的应用,分枝酸通过椅式构象的过渡态重排成预苯酸（罗贵民，酶工程，2003）,临床治疗中的应用,1治疗可卡因成瘾2治疗甲状腺疾病3治疗艾滋(HIV )病4其他方面的应用,Thank you!,
