1、紫外可见光谱分析（UV）,作者：李洋、廖超强中北大学,目录,概述 紫外可见光谱的基本原理 紫外可见光谱图 紫外可见分光光度计 紫外可见光谱的应用,1 概述,紫外-可见吸收光谱（Ultraviolet and Visible Spectroscopy, UV-VIS）统称为电子光谱。紫外-可见吸收光谱法是利用某些物质的分子吸收200800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于有机和无机物质的定性和定量测定。,紫外光的波长范围是100400 nm,远紫外区,这个区域的吸收光谱称真空紫外,近紫外区,一般的紫外光谱是指这一区域的
2、吸收光谱,可见光的波长范围是400800 nm,波长在400800 nm范围的称为可见光谱,常用的分光光度计一般包括紫外及可见两部分，波长在200800 nm(或2001000 nm),紫外光谱法的特点,（1）紫外吸收光谱所对应的电磁波波长较短，能量大，它反映了分子中价电子能级跃迁情况。主要应用于共轭体系（共轭烯烃和不饱和羰基化合物）及芳香族化合物的分析。（2）由于电子能级改变的同时，往往伴随有振动、转动能级的跃迁，所以电子光谱图比较简单，但峰形较宽。一般来说，利用紫外吸收光谱进行定性分析信号较少。（3）紫外吸收光谱常用于共轭体系的定量分析，灵敏度高，检出限低。,（1）、过程：运动的分子外层电
3、子-吸收外来辐射-产生电子能级跃迁-分子吸收谱。 （2）、能级组成： 分子内部的运动有转动、振动和电子运动，相应状态的能量是量子化的，因此分子具有转动能级、振动能级和电子能级。通常，分子处于低能量的基态，从外界吸收能量后，能引起分子能级的跃迁，分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：电子能级跃迁所需能量Ee最大，大致在120eV之间（ Ev次之：0.05-1 eV；Er最小：0.05 eV ）。可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大12个数量级，在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。,分子吸收光谱的形成,2 紫外吸收光谱的基本原理,电子跃迁的类型,有机化合物分
4、子中主要有三种电子：形成单键的电子、形成双键的电子、未成键的孤对电子，也称n电子。仅从能量的角度看，处于低能态的电子吸收合适的能量后，都可以跃迁到任一个较高能级的反键轨道上。跃迁的情况如下图所示：,跃迁时吸收能量的大小 顺序为： n*n* *,一个允许的跃迁不仅要考虑能量的因素，还要符合动量守恒自旋动量守恒，此外，还要受轨道对称件的制约。即使是允许的跃迁，它们的跃迁概率也是不相等的。有机分子最常见的跃迁是*，*，n*，n*的跃迁,（1）* 跃迁 （2）n* 跃迁 （3）* 跃迁 （4）n* 跃迁,电子跃迁类型不同，实际跃迁需要的能量不同， * 150nmn* 200nm* 200nmn* 30
5、0nm 吸收能量的次序为：*n*n*,这两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。,*跃迁 ：它的吸收峰一般处于近紫外光区，在200 nm左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般max104，为强吸收带。如乙烯（蒸气）的最大吸收波长max为162 nm， max= 104 共轭键愈长所需能量愈小.n*跃迁 ： 这类跃迁发生在近紫外光区。它是简单的生色团如羰基、硝基等中的孤对电子向反键轨道跃迁。其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100。,一些无机物也产生紫外-可见吸收光谱，其跃迁类型包括电荷转移跃迁以及配场跃迁。 （1）电荷转移跃迁 (Char
6、ge transfer transition)一些同时具有电子予体(配位体)和受体(金属离子)的无机分子，在吸收外来辐射时，电子从予体跃迁至受体所产生的光谱。max 较大 (104以上)，可用于定量分析。,无机物分子能级跃迁,（2）. 配场跃迁(Ligand field transition) 过渡元素的d或f轨道为简并轨道(Degeneration orbit)，当与配位体配合时，d或f轨道发生能级分裂，如果轨道未充满，则低能量轨道上的电子吸收外来能量时，将会跃迁到高能量的d或f轨道，从而产生吸收光谱。吸收系数 max 较小 (102)，很少用于定量分析；多用于研究配合物结构及其键合理论。,
7、无配场,八面体场,四面体场,平面四面形场,电子跃迁所处的波长范围,2 紫外光谱图,紫外光谱图提供两个重要的数据：吸收峰的位置和吸收光谱的吸收强度。,吸收光谱的吸收强度是用Lambert(朗伯)Beer(比尔)定律来描述的，可用下面的公式来表示：A=lg(I0/I)=cl=lg(1/T)式中A称为吸光度；I0是入射光的强度，I是透过光的强度，T=I/I0为透射比，用百分数表示。l是光在溶液中经过的距离（一般为吸收池的长度）。c是吸收溶液的浓度。=A/(cl)，称为吸收系数(absorptivity)。若c以mol/L为单位，l以cm为单位，则称为摩尔消光系数或摩尔吸收系数，一般用 表示，单位为c
8、m2mol-1（通常可省略）。,常用，lg作为紫外光谱图的纵坐标,光谱曲线中最大吸收峰所对应的波长相当于跃迁时所吸收光线的波长称为max及max相应的摩尔吸收系数为max。max104为强吸收，max103为弱吸收。,3 一些基本概念,（1）发色团 分子中能吸收紫外光或可见光的结构系统叫做发色团或色基。象C=C、C=O、CC等都是发色团。发色团的结构不同，电子跃迁类型也不同。（2）助色团 有些原子或基团，本身不能吸收波长大于200nm的光波，但它与一定的发色团相连时，则可使发色团所产生的吸收峰向长波长方向移动。并使吸收强度增加，这样的原子或基团叫做助色团。,（3）长移和短移某些有机化合物因反应
9、引入含有未共享电子对的基团使吸收峰向长波长移动的现象称为长移或红移(red shift)，这些基团称为向红基团；相反，使吸收峰向短波长移动的现象称为短移或蓝移(blue shift)，引起蓝移效应的基团称为向蓝基团。（4）增色效应和减色效应使吸收强度增加的现象称为浓色效应或增色效应(hyperchromic effect)；使吸收强度降低的现象称为淡色效应或减色效应(hypochromic effect)。,(5) 吸收带分类,i R带它是由n* 跃迁产生的吸收带，该带的特点是吸收强度很弱，max100，吸收波长一般在270nm以上。ii K带 （取自德文： konjuierte 共轭谱带）它
10、是由共轭体系的* 跃迁产生的。它的特点是：跃迁所需要的能量较R吸收带大，摩尔吸收系数max104。K吸收带是共轭分子的特征吸收带，因此用于判断化合物的共轭结构。紫外-可见吸收光谱中应用最多的吸收带。,iii B带（取自德文：benzenoid band, 苯型谱带）它是芳香族化合物的特征吸收带。是苯环振动及* 重叠引起的。在230270nm之间出现精细结构吸收，又称苯的多重吸收。iv E-带（取自德文：ethylenic band，乙烯型谱带）它也是芳香族化合物的特征吸收之一。E带可分为E1及E2两个吸收带，二者可以分别看成是苯环中的乙烯键和共轭乙烯键所引起的，也属* 跃迁。,苯的紫外吸收光谱
11、（异辛烷）,E1带的吸收峰在184nm左右，max104，是由苯环内乙烯键上的电子被激发所致,E2带在203nm处，中等强度吸收，是由苯环的共轭二烯所引起，又称K带。,当苯环上有发色基团取代并和苯环共轭时，E带和B带均发生红移,3 分子结构与紫外吸收光谱,1 有机化合物的紫外吸收光谱 (1) 饱和烃化合物饱和烃类化合物只含有单键（键），只能产生* 跃迁，由于电子由被跃迁至*反键所需的能量高，吸收带位于真空紫外区，如甲烷和乙烷的吸收带分别在125nm和135nm。,如果饱和烃中的氢被氧、氮、卤素等原子或基团取代，这些原子中的n轨道的电子可以发生n*跃迁，其 值一般在几百以下,不饱和化合物由于含有
12、键而具有* 跃迁，* 跃迁能量比*小，但对于非共轭的简单不饱和化合物跃迁能量仍然较高，位于真空紫外区。最简单的乙烯化合物，在165nm处有一个强的吸收带。当烯烃双键上引入助色基团时，* 吸收将发生红移，甚至移到紫外光区。原因是助色基团中的n电子可以产生p-共轭，使* 跃迁能量降低，烷基可产生超共轭效应，也可使吸收红移，不过这种助色作用很弱。,（2）简单的不饱和化合物,当两个生色基团在同一个分子中，间隔有一个以上的亚甲基，分子的紫外光谱往往是两个单独生色基团光谱的加和。 若两个生色基团间只隔一个单键则成为共轭系统，共轭系统中两个生色基团相互影响，其吸收光谱有很大改变。共轭体越长，其最大吸收越移向
13、长波方向，甚至到可见光部分，并且随着波长的红移，吸收强度也增大。,（3）共轭双稀,目前，可以利用Woodward(伍德沃德)和Fieser(费塞尔)规则来估算二烯烃、多烯烃及共轭酮类化合物的紫外吸收置max的位，一般计算值与实验值之间的误差约为5nm。,共轭多烯的紫外吸收计算 Woodward-Fieser规则,Woodward-Fieser规则估算最大吸收波长的几个实例：,( 1)相对于某一个环, 双键必须在环外; ( 2) 双键必须紧连着某一个环; ( 3) 形成共轭的双键 ( 包括母体的双键以及共轭体系延长的双键) 。,环外双键的判断,四,芳香族化合物在近紫外区显示特征的吸收光谱，吸收带
14、为：184nm（ 68000），203.5nm（ 8800）和254nm（ 250）。分别对应于E1带，E2带和B带。,（4）芳香化合物,苯的紫外吸收光谱（异辛烷）,B带吸收带由系列细小峰组成，中心在254.5nm，是苯最重要的吸收带，又称苯型带。B带受溶剂的影响很大，在气相或非极性溶剂中测定，所得谱带峰形精细尖锐；在极性溶剂中测定，则峰形平滑，精细结构消失。,3 影响紫外吸收光谱的因素,3.1 共轭效应,1，3丁二烯分子轨道能级示意图,共轭体系的形成使max红移， 并且共轭体系越长，紫外光谱的最大吸收越移向长波方向。,电子处在离域的分子轨道上，与定域轨道相比，占有电子的成键轨道的最高能级与未
15、占有电子的反键轨道的最低能级的能差减小，使*跃迁所需的能量减少，因此吸收向长波方向位移,3.2 溶剂效应,（1）n*跃迁所产生的吸收峰随溶剂极性的增加而向短波长方向移动。,因为具有孤电子对的分子能与极性溶剂发生氢键缔合，基态的极性大于激发态，因此与基态的作用强度较大，致使基态能级的能量下降较大，而激发态能级的能量下降较小，故两个能级间的能量差值增加。,溶剂对n*的影响,（2）*跃迁所产生的吸收峰随着溶剂极性的增加而向长波长方向移动。,在多数*跃迁中，激发态的极性要强于基态，极性大的*轨道与溶剂作用强，能量下降较大，而轨道极性小，与极性溶剂作用较弱，故能量降低较小，致使及*间能量差值变小。,溶剂
16、对*的影响,3.3 溶剂pH值对光谱的影响,pH的改变可能引起共轭体系的延长或缩短，从而引起吸收峰位置的改变，对一些不饱和酸、烯醇、酚、及苯胺类化合物的紫外光谱影响很大。如果化合物溶液从中性变为碱性时，吸收峰发生红移，表明该化合物为酸性物质；如果化合物溶液从中性变为酸性时，吸收峰发生蓝移，表明化合物可能为芳胺。,（a）苯酚的UV光谱图 （b）苯胺的UV光谱图,4 紫外可见光谱仪基本结构 (以UV2300为例),波长范围：1901100nm,上海天美 UV2300型紫外可见分光光度计,波长准确度：0.3nm,UV2300是一个双光束系统，是用一个半透半反镜将一束光分为参比光和样品光。从光源发出的
17、白光经过单色器经过单色器，在此变成单色光。从单色器发出的光经环形反射镜 (M3)，而后被半反镜(M4)分成参比光束和样品光束。这两束光通过样品室被透镜聚焦，然后到达检测器 (D1和 D2) 并在此转换成电信号。,UV2300的光学系统,因光束几乎同时通过样品池和参比池，因此可消除光源不稳产生的误差。双光束分光光度计适用于在宽的光谱区域内扫描复杂的吸收光谱图，但对生物样品等复杂的试样不易找到合适的参比溶液。,光源发出的复合光通过单色器被分解成单色光，当单色光通过分光镜经过样品室、参比室时，一部分被样品吸收，其余未被吸收的光到达检测器，被转变为电信号，经电子电路的放大和数据处理后，通过显示系统给出
18、测量结果。,紫外可见光谱仪主要部件,光源：分为可见光源和紫外光源。前者常用钨灯，适用波长范围是320800nm；后者常用氘灯，适用波长范围是195375nm。 单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。 棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。 光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕。利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。,吸收池：用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池；紫外区：石英池。检测器：作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。信号显示系统：常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动
19、记录和数字显示装置等。,分光光度计的校正和检验,当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移， 因此需要对其进行校正。1.波长校正 使用镨-钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进行校正。因为二者均有其各自的特征吸收峰。2.吸光度校正 可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L 硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较。,3. 杂散光的检验可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm 石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。,紫外可见吸收光谱的应用,物质的
20、紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团及助色团的特征，而不是整个分子的特征。如果物质组成的变化不影响生色团和助色团，就不会显著地影响其吸收光谱，如甲苯和乙苯具有相同的紫外吸收光谱。 另外，外界因素如溶剂的改变也会影响吸收光谱，在极性溶剂中某些化合物吸收光谱的精细结构会消失，成为一个宽带。所以，只根据紫外光谱是不能完全确定物质的分子结构，还必须与红外吸收光谱、核磁共振波谱、质谱以及其他化学、物理方法共同配合才能得出可靠的结论。（定性分析，定量分析）,定性分析,鉴定的方法有两种： （1）与标准物、标准谱图对照：将样品和标准物以同一溶剂配制相同浓度溶液，并在同一条件下测定，比较光谱是否一致。（2）吸收波
21、长和摩尔吸收系数：由于不同的化合物，如果具有相同的发色基团，也可能具有相同的紫外吸收波长，但是它们的摩尔吸收系数是有差别的。如果样品和标准物的吸收波长相同，摩尔吸收系数也相同，可以认为样品和标准物是同一物质。,定性分析：对照标准吸收图谱，若标准试样与未知物吸收光谱中峰的位置、数目和吸收强度完全一致，可初步确定为同一物质。,结构分析,利用紫外光谱可以推导有机化合物的分子骨架中是否含有共轭结构体系，如CCCC、CCCO、苯环等。利用紫外光谱鉴定有机化合物远不如利用红外光谱有效，因为很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光谱一般比较简单，特征性不强。利用紫外光谱可以用来检验一些具有大的
22、共轭体系或发色官能团的化合物，可以作为其他鉴定方法的补充。,结构分析：紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构有一定价值。,如果一个化合物在紫外区是透明的，则说明分子中不存在共轭体系，不含有醛基、酮基或溴和碘。可能是脂肪族碳氢化合物、胺、腈、醇等不含双键或环状共轭体系的化合物。 如果在210250nm有强吸收，表示有K吸收带，则可能含有两个双键的共轭体系，如共轭二烯或，-不饱和酮等。同样在260，300，330nm处有高强度K吸收带，在表示有三个、四个和五个共轭体系存在。 如果在260300nm有中强吸收（2001 000），则表示有B带
23、吸收，体系中可能有苯环存在。如果苯环上有共轭的生色基团存在时，则可以大于10 000。 如果在250300nm有弱吸收带（R吸收带），则可能含有简单的非共轭并含有n电子的生色基团，如羰基等。,纯度的鉴定,物质纯度不同，对紫外线的吸收度不同，呈一定的比例关系，先测标准物的吸光度，再测样品的吸光度，通过吸光度的比例计算样品的纯度；用紫外可见吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。,定量分析,（1） 单组份定量方法标准曲线法：配制一系列不同浓度的标准溶液，在最佳处分别测定标准溶液的吸光度A，然后以浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标
24、绘制出标准曲线，在完全相同的条件下测定试液的吸光度，并从标准曲线上求得试液的浓度。该法适用于大批量样品的测定。,标准对比法：标准曲线法的简化，即在相同条件下配制样品溶液和标准溶液， 在最佳波长最佳处测得二者的吸光度A样和A标，进行比较，按式计算样品溶液中被测组分的浓度。 吸收系数法：利用标准的吸光系数值进行定量测定时，在适当的波长处测定其吸光度，再以该品种在该条件下的吸收系数计算含量；吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。,（2）多组分定量方法当其它组分在测定波长下与被组分吸收峰产生重叠时，或吸收峰相互干扰的各组分都的分析对象时，吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份，
25、就要采用多组分定量方法。常用方法：A、联立方程法B、双波长法C、系数倍率法,A、联立方程法,设试样中有两组份 X 和 Y，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：,图a)：X,Y 组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。 图b)和c) ：X,Y 相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X和Y的浓度,其中，X,Y 组份在波长 1 和 2 处的摩尔吸光系数 可由已知浓度的 X, Y 纯溶液测得。解上述方程组可求得 cx 及 cy。,当混合物的吸收曲线重迭时，如右下图所示，可利用双波长法来测定。具体做法：将 a 视为干扰组份，现要测定 b 组份。 1) 分别绘制各自的
26、吸收曲线；2) 画一平行于横轴的直线分别交于a组份曲线上两点，并与b组分相交；3) 以交于 a 上一点所对应的波长 1 为参比波长，另一点对应的为测量波长 2，并对混合液进行测量，得到：A1=A1a + A1b + A1sA2 =A2a + A2b + A2s 若两波长处的背景吸收相同，即A1s= A2s 二式相减，得，A=(A2a- A1a)+( A2b- A1b) 由于 a 组份在两波长处的吸光度相等， 因此，A=( A2b- A1b)=(2b-1b)lcb 从中可求出cb 同理，可求出ca。,B、双波长法-等吸收点法,情况同上。但其中一干扰组份 b 在测量波长范围内无吸收峰时，或者说没有等吸收点时可采用该法。 具体做法：同前法可得到下式， A1=A1a + A1b A2 =A2a + A2b 两式分别乘以常数k1、k2并相减，得到， S=k2(A2a+A2b)-k1(A1a+A1b)=(k2A2b-k1A1b)+(k2A2a-k1A1a) 调节信号放大器，使之满足k2/k1=A1b/A2b，则 S=(k2A2a-k1A1a)=(k22-k11)lca 因此，差示信号只与 ca 有关，从而求出 ca。同样可求出cb。,C、系数倍率法,Thank You !,
