1、RTCA (Real Time Cellular Analysis)技术原理及应用领域 技术支持 张浩彬 艾森生物（杭州）有限公司 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO Life Science Research Models Physiological and biological process Pathological conditions: disease models Animal Cells Gene, DNA Molecules Cells play a central role in life science re
2、search RNA Proteins, Receptors, etc 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 细胞接种 药物处理 标记 Fluorescence: FI, FP, FRET; Luminescence: CL, ECL; radioisotope: Filtration, Scintillation Proximity Assay) 传统终点检测 数据分析 1-24 小时 Black Box 传统细胞实验方法 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 细胞
3、接种 药物处理 数据分析 自动实时动态检测及数据分析 RTCA实时无标记检测 细胞接种 药物处理 标记 &终点检测 传统终点检测 数据分析 1-24 小时 Black Box 传统终点检测到实时无标记检测 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO RTCA (Real Time Cellular Analysis) 检测原理 基于微电子阻抗技术的细胞检测方法 阻抗检测： 细胞形态学变化 (细胞的大小，形状，贴壁情况，伸展 ) 细胞数量 细胞的粘附力 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential A
4、CEA BIO - Each well contains an inter-digitated gold electrode on the well bottom - Each digit of the gold electrode has a string of pearls“ shape - The gold electrode covers 80% of the bottom area Cells on the well bottom 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO Cell Index (细胞指数 )： 无量纲的参数
5、； 由测得的阻抗值换算获得； 反映细胞表型的变化（增殖、死亡、形态、大小等） 细胞指数 ： 什么是细胞指数？ 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 细胞指数和 细胞数、细胞粘附力及形态的关系 16000 8000 2000 4000 Cell Number Cell Index 8.3 4.6 1.9 0.9 0 min 5 min 20 min 00 . 20 . 40 . 60 . 810 m i n 5 m i n 2 0 m i nT i m eCellIndex 2012 ACEABIO Proprietary and
6、Confidential ACEA BIO 细胞黏附伸展 细胞对数增殖期 如何解读 细胞指数 曲线？ 细胞的大小 /黏附度 细胞的数目 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 如何解读 细胞指数 曲线？ 细胞瞬时形态变化 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO iCELLigence 及 xCELLigence 系列产品（一） 产品 培养 /处理 检测通量 细胞增殖/QC/细菌病毒介导的细胞毒性 /受体配体相互作用 /细胞间作用 细胞迁移 /浸润 心脏毒性 /心肌细胞功能
7、 数据 传输 染色 /镜检/观察 直接成像 始终位于 培养箱内 2x8孔 无线WiFi， iPad操作 E-plate 直接进行 视窗直接实现成像，无需平行样 始终位于 培养箱内 1x96孔 数据线 E-plate 直接进行 视窗直接实现成像， 无需平行样 始终位于 培养箱内 6x96孔 数据线 E-plate 直接进行 视窗直接实现成像， 无需平行样 RTCA SP 1X96 RTCA MP 6X96 iCELLigence（ 2012） 11 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO iCELLigence 及 xCELLigen
8、ce 系列产品（二） 产品 培养 /处理 检测通量 细胞增殖/QC/细菌病毒介导的细胞毒性 /受体配体相互作用 /细胞间作用 细胞迁移 /浸润 心脏毒性 /心肌细胞功能 数据 传输 染色 /镜检/观察 直接成像 始终位于 培养箱内 4x384孔 数据线 E-plate 直接进行 视窗直接实现成像， 无需平行样 始终位于 培养箱内 3x16孔 数据线 E-plate 直接进行 视窗直接实现成像， 无需平行样 始终位于 培养箱内 1x96孔 数据线 E-plate 直接进行 视窗直接实现成像，无需平行样 RTCA Cardio 1X96 RTCA HT 384 4X384 RTCA DP 3X16
9、 12 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO RTCA 实时无标记动态 检测流程 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO RTCA 的 检测优势 Discover What You Have Been Missing Capture Biology As It happens 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO RTCA的实时动态检测指示最佳实验流程 2012 ACEABIO Proprietary an
10、d Confidential ACEA BIO RTCA的实时动态检测指示最佳检测时间 16 细胞凋亡检测 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 受体 -配体 相互作用 细胞迁移 和浸润 细胞 /微环境相互作用 细胞毒性 RTCA在细胞学研究中的应用 细胞质控 细胞粘附 和伸展 病毒 CPE R a t P rim a ry C a rd io m y o c y te s- 0 .0 4- 0 .0 200 .0 20 .0 40 .0 60 .0 80 .10 .1 20 200 400 600 800 1000 1200 1
11、400 1600M e a s u r e m e n t P o in t s ( D T = 1 2 .8 m s )Cell Index心肌细胞功能检测 新药筛选 基因调控 ADCC 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 18 RTCA 全球部分用户 湖北 CIQ 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO RTCA 传统方法 细胞增殖检测 细胞毒性或细胞凋亡检测 化合物、细菌毒素、病毒和细胞及细胞因子等介导的细胞毒性 MTT, XTT, WST-1, H-thymi
12、dine or BrdU incorporation LDH Release Plaque-forming assays 肿瘤细胞与微环境的相互作用 CCD 配体受体相互作用介导的细胞响应，包括酪氨酸激酶活性 Ligand-binding (SPA, Biacore) Receptor ELISAs 细胞迁移及浸润 Boyden Chamber assay/ Matrigel assay RTCA在基础研究中的应用 肿瘤细胞学 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 肿瘤信号传导 检测 RTK信号通路的细胞响应 TR-FRET EL
13、ISA 现有检测方法： 细胞内蛋白水平的检测 步骤繁琐 成本高 大量实验优化 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO Phalloidin Anti-Rac EGF EGFR Inhibitor 0 min 5 min 20 min 20 min + + + - + - - - 肿瘤信号传导 RTCA检测 EGF/EGFR信号通路的细胞响应 0 . 811 . 21 . 41 . 61 . 820 2 4 6 8 10 12T i m e ( h o u r s )NormalizedCellIndexEG FI n s u l i
14、 n0 . 811 . 21 . 41 . 61 . 820 2 4 6 8 10 12T i m e ( h o u r s )NormalizedCellIndexEG F + EG F i n h i b i to rI n s u l i n + EG F i n h i b i to rRTCA检测方法： 检测细胞表型的变化 简化步骤 降低成本 捕捉细胞的瞬时及长时效响应 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 上海市第六人民医院装机实验 RTCA检测抗肿瘤药物的细胞毒性作用 药物的临床治疗探索 单药细胞水平的疗效 联合用
15、药、分期用药的剂量、时间 药物结合基因调控治疗的剂量、方案设计 22 200 nM Paclitaxel 100 nM Paclitaxel 50 nM Paclitaxel 25 nM Paclitaxel 12.50 nM Paclitaxel 6.25 nM Paclitaxel DMSO control Only media A549 5k cells/well 药处理前一时间点（ time:16:43:22） Cell Mean CI SD CV A549(5000) 0.8662 0.0635 7.33% 药处理一定时间 IC50值 Time 24 h 48 h 72 h IC50
16、 98.6 nM 97.2 nM 95.8 nM 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 肿瘤转移过程中的细胞迁移及浸润 恶性肿瘤的表现 转移的发生与否，常被视作癌症患者病程的严重程度以及治疗效果的指标 肿瘤转移则是癌症患者死亡的最主要原因 23 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 肿瘤 细胞迁移浸润 Conventional Transwell Assay RTCA Migration/Invasion Assay 大大简化实验步骤 实时定量检测细胞迁移 /浸润 2
17、012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO 肿瘤 细胞迁移浸润 xCELLigence-CIM CIM 16 Well Device xCELLigence DP 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO Chemotaxis = directed movement toward soluble factors (chemicals, growth factors, food, etc.) Haptotaxis = directed movement along immobile
18、 gradient (chemicals, growth factors, food, etc.) 0 1 2 3 4 5 0 5 10 15 20 25 Cell Index Time (hours) 40000-10% Serum 20000-10% Serum 40000 SFM 20000 SFM 00 . 20 . 40 . 60 . 811 . 21 . 40 2 4 6 8T i m e (h o u r s )CellIndex2 0 u g / m L F N1 0 u g / m L F N5 u g / m L F NB S A C t r lRTCA实时监测肿瘤细胞迁移
19、 26 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO RTCA研究 小分子的细胞迁移抑制作用 Locostatin- Inhibitor of RKIP 5h 10h 15h 20h 24h 50 mM 25 mM 12.5 mM 6.3 mM 3.3 mM 1.6 mM SFM 10% FBS IC50 vs. time 14 mM 17 h 实现迁移抑制剂的时间量效作用的动态检测 时间依赖的 IC50检测及计算显示抑 制剂的动力学 ， slow&fast acting compound？ 药物对恶性肿瘤细胞迁移抑制的 时间效应 剂量效
20、应 27 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO RTCA在基础研究中的应用 免疫学 NK细胞介导的 ADCC作用 肥大细胞的致敏及脱颗粒 00 . 511 . 522 . 520 30 40 50 60T i m e ( H o u r s )NormalizedCI1 6 : 18 : 14 : 12 : 11 : 10 . 5 : 10 . 2 5 : 1M e d ia O n ly00 . 511 . 522 . 50 0 . 2 5 0 . 5 1 2 4 8 16E / T R a t i o ( x / 1 )Nor
21、malizedCI00 . 10 . 20 . 30 . 40 . 50 . 60 . 70 . 8AbsorbanceUnitsR T - C E SM T T28 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO Yama A. Abassi, et al., J Immuno Methods 292 (2004) 195205 RTCA实时检测 IgE介导的肥大细胞 致敏脱颗粒 实时连续动态监控，可检测各种微小或显著性细胞状态改变 细胞动态变化指示其它检测的最佳检测时间点 均一性和定量分析，检测敏感性高 2012 ACEABIO Proprietary and Confidential ACEA BIO Douglas Hanahan and Robert Weinberg, Cell 144, 646-674 肿瘤微环境 肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展 全身和局部组织亦可通过代谢、分泌、免疫、结构和功能的改变，限制和影响肿瘤的发生和发展 对于认识肿瘤的发生、发展、转移等有着重要的意义，而且对于肿瘤的诊断、防治和预后亦有着重要的作用 30
