1、摘要 建立了一种鉴定牛羊肉中掺杂猪肉的 PCR 检测方法。确定了一对在牛羊肉中特异并能被灵敏地检测出所含掺杂猪肉成分的引物对，以猪细胞色素 b 基因组为模板，特异性扩增出 130bp 的目的片段，而无其他扩增片段影响。在牛羊肉中分别掺杂0.2%、 0.4%、0.6%的猪肉，均可灵敏地检测出猪肉成分，无显著性差异；分别经 120、10min ，120、30min，115、30min，70、16h 处理猪肉后，也可灵敏地扩增出特定目的条带，无显著性差异。关键词 PCR 技术； 猪肉； 鉴定在国内及国际贸易中，牛、羊肉中掺杂价格便宜的猪肉，以次充好的欺骗行为屡见不鲜,严重损害了消费者的利益。20 世
2、纪 80 年代，国外开始对肉的种属鉴定进行研究，采用的方法主要有 DNA 杂交、免疫扩散和等电点聚焦等，这些方法大都存在着成本高、工作量大、对检测对象要求高等缺点 1-2。因此，建立一种能快速、灵敏、特异地检测生熟猪肉的检测方法一直是有待解决的难题。本研究根据猪细胞色素 b 的 DNA 序列，设计并最后确定了 1 对特异引物 3-5，建立了运用 PCR 技术鉴定牛羊肉中搀杂生、熟猪肉的方法，为杜绝贸易中的欺骗行为提供了快捷可靠的检验方法。1 材料与方法1.1 材料与仪器各种动物肉样品采自北京市各超市；不同温度的处理肉由本实验室加工；蛋白酶K、RNA 酶、dNTP、10PCR 缓冲液(含 Mg2
3、+)、TaqDNA 聚合酶、50bp ladder DNA marker等购于北京天根生化科技有限公司。实验仪器：BIO-RAD PCR 扩增仪、BIO-RAD 凝胶成像仪及电泳系统、台式离心机。1.2 实验方法1.2.1 PCR 引物的设计与合成根据猪细胞色素 b 的 DNA 序列，设计并确定 1 对特异猪引物序列，上游引物序列为 5-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3；下游为 5-AATTTGCGCATTGTGCGTCA-3，并由上海生工生物工程有限公司合成。取适量引物用高压灭菌后的超纯水溶解，配制成100mol/L 的储备液。1.2.2 DNA 模板的提取 总 DNA
4、 提取步骤如下：15mL 离心管中加入约 50mg 样品，加 200LTE 溶解(pH8.0)，涡旋混匀；加入 400L 裂解液，混匀后加 600L 酚氯仿异戊醇(25241) 混合溶剂，剧烈振荡，12000g 离心 10min；取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇 (241)混合溶剂，剧烈振荡，12000g 离心 10min；取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡， 12000g 离心10min；取上清液，加 0.8 倍体积异丙醇，12000g 离心 10min；取沉淀，用 70%乙醇清洗1 次，在室温或 50下，20min 晾干；加 80LTE(pH8.0)溶解。也可用等效动物基因组提取试剂盒提
5、取基因组 DNA。1.2.3 PCR 方法 PCR 反应体系为 50L，各成分含量为：10缓冲液 5L，2.5mM 4dNTPs 1L，引物1L， 引物 1L，模板 10L，25mM MgCL 23L，无菌超纯水 25L，2.5L (2.5u/L ) Taq DNA 聚合酶，混匀后离心，在 PCR 仪上开始循环。循环参数为：94预变性 240s，然后进行 37 个循环，每个循环为 94变性 30s，50、30s，72、60s, 37 个循环后 72保温延伸 5min。取扩增产物 10L，在 2.5%琼脂糖凝胶中电泳，采用 0.5*TBE 电泳缓冲系统，5V/cm 恒压电泳，50bp ladde
6、r 作为分子量对照。电泳后，EB 染色，于凝胶成像仪下观察结果。1.2.4 特异性、敏感性实验 在干燥箱中经 7016h 分别干燥猪肉、牛肉和羊肉，用研钵研磨制备猪肉、牛肉和羊肉粉末，分别制备含 0.2%、0.4%、0.6%的猪肉的牛肉及同样猪肉含量的羊肉，按照上述方法提取 DNA 并电泳检测扩增效果。1.2.5 不同加热温度对检测效果的影响在干燥箱中经 7016h 干燥猪肉，在高压灭菌锅中分别经 115、30min ，120、10min，120、20min，120、30min 和 100、60min 加热处理鲜猪肉，然后按照上述方法分别提取 DNA 并电泳检测扩增效果。2 结果与讨论2.1
7、引物对的特异性及敏感性将含 0.2%、0.4%、0.6% 猪肉的牛肉及同样猪肉含量的羊肉，按照上述方法提取 DNA 并电泳检测扩增效果，结果见图 1，均能得到 130bp 的目的 DNA 条带，无非特异性杂带，说明该引物对能在牛肉或羊肉中特异性的检测出含量高于 0.2%的猪肉成分。将经过不同温度和时间处理的猪肉样品按照上述方法提取 DNA 后进行 PCR 反应，电泳结果见图 2，从图中可见这几种处理对 PCR 反应无显著性影响，说明该方法可以用于高温处理过肉制品的检测。肉制品由于灭菌等工艺的要求，经常需经过不同高温和时间的处理，从而导致目标片段变小，影响 PCR 反应效果，因此所扩增的目的片段
8、越大，受温度影响越大，检测结果越差。本方法中所设计引物扩增目的片段为 130bp，相对较小，受温度影响很小。2.3 实际样品鉴定结果从超市购买销售比例较大并标明主要成分的几种肉制品，用上述方法提取 DNA 并进行检测，每个样品重复 2 次，电泳结果见图 3。由图可见，三文治、盐水方腿、火腿肠等含有猪肉的肉制品均可检出目的条带，有个别样品平行性不太好，可能与称取 50mg 样品时没有进行样品均质有关。所有结果说明，该方法可以用于市场上大部分肉制品中猪肉成分的检测，其他种类的动物成分及植物成分没发现有非特异性扩增现象。参考文献1 钟伟军，陈金顶. PCR 检测饲料中牛源组织成分的研究 J. 华南农
9、业大学学报， 2006，27（3）：33-36.2 潘良文，陈家华，丁燕，等. 进口肉骨粉中牛成分检测研究J. 生物技术通报，2001，5：23-26.3 杨宝华，宗卉. 根据线粒体基因的特异性鉴别检测饲料中的动物源性成分J. 科学试验与研究，2002，5：1-3.4 Calvo J H, Zaragoza P, Osta R. Technical note: A quick and more sensitive method to identify pork in processed and unprocessed food by PCR amplification of a new specific DNA fragment J. J Anim Sci, 2001(79):2108-2112.5 Soichi T, Eiji M, Kazuhiro M, et al. PCR method of detecting pork in foods for verifying allergen labeling and for identifying hidden pork Ingredients in processed foods J. Biosci Biotechnol Biochem, 2007, 71(7): 1663-1667.
