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类型蛋白质印迹手册2015.pdf

  • 上传人:精品资料
  • 文档编号:9417491
  • 上传时间:2019-08-06
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    蛋白质印迹手册2015.pdf
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    1、蛋白印迹技术手册(第六版) 基本原理 操作详解 经验技巧 疑难解答 常用工具 默克密理博生命科学部密理博(Millipore)公司成立于1954年,总部位于美国麻 省,主要生产膜及以膜为核心的衍生产品。2010年默克 集团成功并购密理博公司,成立了新的具有强大创新能 力默克密理博部门,为全球生命科学用户提供更加有效 的解决方案和完整的产品线。膜的传奇还在继续 默克密理博的膜技术产品 全面支持您的高效生命科学研究 Millex针头式过滤器 适合200mL样品过滤、除菌 以外观颜色区分膜材质(PES绿,PVDF黄,MCE蓝等) 直径、膜材质、膜孔径、包装规格齐全 行业领先:最快:Millipore

    2、 Express PLUS PES系列蛋白结合损失最低:Durapore PVDF系列 Stericup/ Steritop过滤器 适合1501000mL培养基过滤、除菌 膜孔径、包装规格齐全 精巧设计带来满意体验 行业领先:最快:Millipore Express PLUS PES系列蛋白结合损失最低:Durapore PVDF系列 Amicon Ultra超滤管 用于蛋白、核酸、病毒、微粒等快速浓缩、除盐及换液 处理体积、截留分子量、包装规格齐全 行业领先:再生纤维素膜蛋白结合损失最低双竖膜、死体积及反转回收等精巧设计带来满意体验 Millicell悬挂式/ 站立式细胞培养小室 细胞/组织

    3、立体培养,细胞运动,共培养和结合实验等 膜孔径、膜材质、包装规格齐全 行业领先:PET悬挂式操作最方便PCF站立式文献引用率高 Immobilon转印膜 Blotting技术的基石,Western必备 高载量,兼容各种检测方法 行业领先:0.45m最经典的通用转印膜0.22m载量最高,适合20kDa和低丰度蛋白检测FL特别改良用于荧光检测,背景低于NC膜 MultiScreen高通量滤膜板 符合自动化操作规范,性能稳定,数据可比性好 行业领先:亲水性PVDF膜蛋白结合损失最低疏水性PVDF膜蛋白载量最高,ELISpot专用超滤膜板用于大分子高通量操作 膜 技 术 行 业 标 杆 产 品 默 克

    4、 密 理 博 微滤 去除颗粒物,除菌 Millipore Express PLUS PES膜 过滤速度最快 Millex针头式过滤器:处理体积200mL,直径33mm规格系列最常用(cat# SLGP033RB等) Steriip过滤器:处理体积50mL Stericup/Steritop过滤器:处理体积150mL-1L (cat#SCGPT05RE,cat#SCGPT10RE,cat#SCGPU05RE) Sterivex过滤器:处理体积2L(cat#SVGPL10RC) Stericap过滤器:处理体积2-10L cat#SCGPCAPRE Steripak过滤器:处理体积10-20L c

    5、at#SPGPM10RJcat#SPGPM20RJ 亲水性Durapore PVDF膜 蛋白吸附最低,含蛋白样品过滤首选 Millex针头式过滤器:处理体积100mL,直径33mm规格系列最常用 (cat# SLHV033RB等) Steriip过滤器:处理体积50mL(cat#SE1M003M00) Stericup/Steritop过滤器:处理体积150mL-1L(cat#SCHVU11RE等) Sterivex过滤器:处理体积1L Ultrafree系列离心微滤管:处理体积0.5或2mL,提供预除菌形式包装 MCE(混合纤维素)膜 经典常用膜 Millex针头式过滤器:多种孔径/直径可供

    6、选择 亲水性PTFE膜 化学耐受性最好 Millex针头式过滤器:多种孔径/直径可供选择 Ultrafree系列离心微滤管:处理体积0.5或2mL,提供预除菌形式包装 疏水性Durapore PVDF膜及疏水性Fluoropore PTFE膜 气体过滤,在线传感器保护 Millex针头式过滤器:多种孔径/直径/接头可供选择 玻璃纤维膜 预过滤 Millex针头式过滤器:多种孔径/直径可供选择 尼龙膜 预过滤,单细胞分离 Steriip过滤器:多种孔径可供选择 超滤 蛋白/核酸/病毒的浓缩、除盐、缓冲液置换 再生纤维素膜 超低蛋白吸附超滤膜 Amicon Ultra系列超滤管(cat# UFC9

    7、01096等) Amicon Pro纯化超滤管:1mg以内蛋白样品操作新标准工具 新! D-tube系列透析管:温和换液、浓缩、电洗脱 Microcon 系列超滤管:DNA、蛋白浓缩;法医刑侦专用 Centricon Plus-70系列超滤管:15-70mL样品浓缩 Stirred Cell系列超滤杯:3-400mL高浓度样品温和浓缩,可换膜 PES超滤膜 孔结构松弛,适合浓度/粘度高的样品 Stirred Cell系列超滤杯:3-400mL高浓度样品温和浓缩,可换膜 细胞培养表面 三维生长,细胞运动,结合物分析 PET(聚乙烯对苯二酸酯)膜:用于贴壁细胞的生长,无需胞外基质 Millicel

    8、l PET悬挂式细胞培养小室(cat#PIHT12R48,cat#PIRP12R48,cat#PIEP12R48) 亲水性Isopore PCF(聚碳酸酯)膜:用于贴壁细胞的生长,无需胞外基质 Millicell 站立式细胞培养小室(cat#PIHP01250,PI8P01250) Millicell 24孔培养板(cat#PSHT010R5) 亲水Biopore PTFE(聚四氟乙烯):低蛋白吸附、可进行活细胞观察以及免疫 荧光等应用 Millicell站立式细胞培养小室(cat#PICM03050,PICM01250,器官型PICM0RG50) 高通量分析 小体积、多样品操作 疏水性PVD

    9、F膜 蛋白吸附最好的膜,细胞因子高灵敏检测首选 MultiScreen 96孔板或8链条:用于亲和素-生物素相关分析、DNA结合蛋白分析、效应作用分析、蛋白互作分析等,是业界公认的ELISpot专用板(cat#MSIPS4510 ,M8IPS4510) 亲水性PVDF膜 蛋白结合最低的膜 MultiScreen 96孔板:用于完整细胞/细胞部分受体结合分析,蛋白激酶/磷酸酶沉淀分析,珠子/树脂形式分析,新生儿(苯丙酮尿症)筛查(cat#MSHVN4550) MultiScreen 96孔板:通过临床诊断应用验证,用于蛋白激酶/磷酸酶分析、样品制备、末端染料去除(测序用)(cat#MAHVN45

    10、50) 亲水性PTFE膜 MultiScreen 96孔板:用于天然产物筛选,可溶性分析,总药物分析(cat# MSRLN0410) PCF膜 Millicell 96孔板:用于Caco-2细胞培养及细胞水平分析,包括细胞渗透性/粘附/培养/分化/药物转运等(cat#PSHT004S5) 再生纤维素膜 MultiScreen 96孔板:用于蛋白浓缩、除盐、缓冲液置换(cat# MAUF01010) 其它膜 MultiScreen 96孔或384孔板:用于纯化PCR产物、去除dNTPs和引物(cat#LSKMPCR10) 印迹研究 对生物大分子有卓越的吸附能力 疏水性PVDF转印膜 蛋白载量最大

    11、的膜 Immobilon-P 0.45m最常用的WB转印膜(cat# IPVH00010) Immobilon-P SQ0.2m小分子蛋白/肽WB转印膜(cat# ISEQ00010) Immobilon-FL 0.45m背景最低的荧光检测专用转印膜(cat# IPFL00010) 硝酸纤维素(NC)转印膜 Immobilon-NC 0.45m传统WB常用转印膜(cat# HATF00010) 更好的膜, 更好的印迹。 关于第六版 1. Southern E. J Mol Bio 1975;98:503. 随着蛋白印迹手册第六版的 出版,默克密理博公司一如 既往地协助研究人员紧跟蛋 白检测的前

    12、沿进展。我们在 优化抗体浓度和降低背景方 面增加了更全面的建议,同 时扩展了荧光检测的数据和 操作步骤。 这本手册代表了我们应用科 学家的集体经验和智慧 正是他们一直积极参与推进 蛋白印迹和检测技术。这本 手册也包含了我们技术服务 专家团队所提供的许多最常 见的建议,世界各地的科学 家常常联系他们寻求帮助。 近四十年来,默克密理博一直是转印膜的领 先供应商。1975年,E.M. Southern使用这些膜 首次创建了从琼脂糖凝胶上转移核酸 1 。第一 款用于Western印迹的0.45m-PVDF基质, Immobilon-P膜,在1985年面市,而第一款 用于蛋白印迹和测序的0.2m-PVD

    13、F基质, Immobilon-P SQ 膜,在1988年面市。 除了Immobilon膜和试剂,默克密理博还为 蛋白研究提供了广泛的其它工具,包括温和 高效的蛋白提取试剂盒,通过PureProteome 磁珠快速分离蛋白,以及通过Amicon-Ultra 离心超滤管高效浓缩除盐。 从何处获得更多信息 如果您有问题或需要协助,请联系默克密理 博的技术服务专家团队: 电话:400-889-1988-2分机 邮箱: 您还可以在中文ProMart蛋白研究产品超市网 站上下载更多相关资料或查阅产品详情。目 录 蛋白印迹技术简介 3 1 膜的选择 4Immobilon PVDF转印膜 2 蛋白结合 10I

    14、mmobilon-P 还是 Immobilon-P SQ转印膜?影响蛋白结合的因素 3 印迹方法:原理与优化 11 过滤 11 Western印迹 12在1-D或2-D凝胶上分离复杂的蛋白混合物分子量标准品聚丙烯酰胺的浓度凝胶电泳缓冲液蛋白从凝胶转移到膜上 电转印技术 转印缓冲液 甲醇在转印缓冲液中的功能 影响蛋白成功转移的因素 SDS的存在 电流和转印时间 转印缓冲液的pH值 平衡时间 建立一种新的转印操作 尝试建立蛋白鉴定的膜 用于染色和免疫检测 通过透照法观察和快速免疫检测 保存 透照 染色 可逆染料 不可逆染料 缓冲液 封闭 抗体 清洗 间接印迹 检测底物蛋白观察4 蛋白鉴定 23 免

    15、疫检测 23标准或快速免疫检测步骤影响免疫检测的因素多轮杂交Immobilon PVDF转印膜 质谱分析 29利用Immobilon PVDF转印膜进行质谱分析 1 显色检测 化学发光检测 荧光检测2 目录(续) 5 操作 31 1 蛋白转印的操作 32 1.1 电转印:槽转印 1.2 电转印:半干转印 1.3 斑点印迹/狭缝印迹:真空过滤法 1.4 Spot印迹:手工点样法 1.5 封闭试剂的优化 1.6 膜干燥方法 1.7 创新方法:间接印迹以避免二抗的非特异性结合 2 蛋白观察的操作 41 2.1 通过透照法观察 2.2 通过可逆染色观察丽春红CPTS(酞菁铜四磺酸) 2.3 通过不可逆

    16、染色观察考马斯亮蓝R染料氨基黑 3 免疫检测的操作 44 3.1 标准的免疫检测方法 3.2 快速的免疫检测方法 3.3 利用SNAP i.d. 2.0系统进行快速的免疫检测 3.4 高盐溶液清洗以去除顽固的背景 4 剥离膜上抗体的操作 51 4.1 通过加热和去污剂剥离 4.2 通过低pH条件剥离 4.3 利用ReBlot Plus Western Blot Recycling Kit剥离 5 蛋白消化的操作 53 5.1 消化膜上蛋白以便进行质谱分析 6 印迹膜保存的操作 经验之谈:从容应对高难度Western Blotting 实例分析与建议 专家之选Western Blotting常用

    17、工具 54 6.1 印迹膜制备以便长期保存 6 常见问题与改善建议 55 词汇表 参考文献 专利 7 附录 66 66 68 74简介 3 自1979年被建立以来(Towbin等, 1979)蛋白印迹已成为研究型实验室的 一种常规方法。它通常用于检测复杂样 品中的少量目的蛋白,或监控蛋白表达 与纯化。最简单的蛋白印迹操作被称为 斑点印迹或狭缝印迹,是用真空抽滤将 蛋白转移到一块微孔膜上。尽管这种方 法可提供蛋白整体表达水平的定量信 息,并可以平行开展多个样品的检测, 但它缺乏蛋白分子量的信息。同时特异 性也会受影响,因为蛋白降解产物或翻 译后修饰的异构体也能随着完整蛋白一 起被检测。 West

    18、ern印迹是一种更为复杂的操作,它 包含通过凝胶电泳来分离蛋白混和物, 随后电转移到适当的膜(如PVDF)上。 在蛋白转移至PVDF膜后,它们可被染色 以便观察,也可直接通过N端测序、质 谱分析或免疫检测来鉴定。免疫检测是 通过蛋白与特异抗体的反应来鉴定这种 蛋白。通过空间分辨,这种方法能够提 供各个蛋白的分子量信息,并能区分异 构体、选择性加工产物及其它的翻译后 修饰形式。 在临床实验室,免疫印迹已在传染病和 自身免疫性疾病、过敏及其它领域被证 明是非常有用的(Towbin等,1989; Stahl等,2000)。Western印迹被公认是 在病毒感染过程中,配合ELISA共同诊断 的一种可

    19、靠的临床检测方法,也是一种 灵敏、明确而简单的分析,可提供内涵 丰富的信息(Bauer,2001;Mylonakis 等,2000;Heermann等,1988)。 Western印迹的应用实例包括通过定量 Western分析来分析酵母中的蛋白表达 (Ghaemmadami等,2003),蛋白拷贝 数和亚细胞器分布(compart- mentalization)的鉴别(Rudolph等, 1999),ATP竞争性蛋白激酶抑制的研 究(Wang和Thompson,2001),以及 作物和食品中转基因生物的检测 (Ahmed,2002)等。 蛋白印迹一直以来都是探索性研究的理 想平台,也依然是评估

    20、新抗体及其它蛋 白检测分析方法(如ELISA、基于磁珠 的分析、流式细胞分析和免疫组化)的 标准。然而,同时分析更多蛋白以鉴定 复杂的蛋白互作网络的需求,以及保留 珍贵样品的相关需求,也一直在推动印 迹技术在灵敏度和操作便利性等方面不 断改进。例如创新的“间接印迹 (double-blotting)”方法(Lasne, 2001,2003),可消除由印迹蛋白与无 关二抗之间强的非特异性相互作用造成 的假阳性。Far-Western印迹技术可实现 蛋白间特异相互作用的检测(Grasser, 1993),而Southwestern印迹被用于鉴 定与特定DNA序列相互作用的蛋白 (Silva,198

    21、7)。Multistrip Western印迹 被证明能提高通量,同时最大限度减少 印迹间的可变性(Aksamitiene, 2007)。新一代印迹技术的特点是产生 信号所需的蛋白减少(Swank, 2006),以及改善Western印迹的定量 能力(Schilling,2005a;2005b)等。4 根据膜材质的特性选择转印膜,涉及 以下几方面的考虑: 膜的选择 1 蛋白结合能力 是否需要用醇预湿 开展多次剥离(stripping)和再次检测 (reprobing)实验的能力 蛋白观察 长期印迹保存 信噪比 聚偏二氟乙烯(PVDF)和硝酸纤维 素(NC)是Western印迹应用中最 常用的两

    22、种类型的膜。 与硝酸纤维素膜相比,电转到PVDF膜 上有许多优点。PVDF膜可提供更好的 蛋白截留率、物理强度和广泛的化学 兼容性(Pluskal等,1986)。其中更高 的机械强度和出色的耐化学性使PVDF 膜成为免疫检测中各种染色应用和多 次检测的理想选择。使用PVDF膜的另 一个优点是,从单块凝胶上转移的平 行重复泳道可用于后续各种应用,如 考马斯蓝染色,接着切割条带进行N端 测序,蛋白水解/肽段分离/内部测序, 以及免疫检测(Kurien等,2003)。市 售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是 80 100 g/cm 2 ,而PVDF膜的结合能力 是100 200 g/cm 2 。 在检测

    23、血清中人免疫缺陷病毒(HIV) 抗原的实验中,平行比较PVDF和硝酸 纤维素膜的使用效果,结果表明PVDF 膜有更好的总体截留率,并且有助于 改善抗体对糖基化包膜抗原的检测( Lauritzen和Pluskal,1998)。硝酸纤维 素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。特性/应用 硝酸纤维素 PVDF 物理强度 差 好 蛋白结合能力 80 100 g/cm 2 100 300 g/cm 2 耐溶剂性 否 是 Western转移 是 是 总蛋白染色 胶体金 胶体金 丽春红 丽春红 氨基黑 氨基黑 印度墨汁 印度墨汁 Sypro 印迹染料 考马斯蓝染料 检测 显色 显色 化学发光 化学发光 荧光

    24、荧光 放射性 化学荧光 放射性 间接印迹方法 否 是 快速免疫检测 否 是 Western再次杂交 否 是 Edman测序 否 是 氨基酸分析 是 是 SDS存在下的结合 差 好 膜上消化或质谱分析 否 是 直接MALDI-TOF MS分析 否 是 数据可存档 否 是 表1. PVDF和硝酸纤维素转移膜特性及应用的比较 5 有了Millipore的创造性贡献,我们现在有了最好的Western Blotting 1975年,Dr. Southern使用Merck Millipore的硝酸纤维素膜发明了Southern Blotting技术 1979年,Dr. Towbin使用Merck Mill

    25、ipore的硝酸纤维素膜发明了Western Blotting技术 1985年,Merck Millipore发明了世界上第一张0.45m PVD膜 (Immobilon-P) 1988年,Merck Millipore发明了世界上第一张0.2m PVD膜 (Immobilon-P SQ ),提高小分子蛋白检测效率 再后来,Merck Millipore上市了世界上第一张0.45m 荧光检测专用PVD膜 (Immobilon-FL) 现在Immobilon成为转印膜的代名词,在实验室中支持您获得每一次WB检测的成功 (* 2010年默克集团成功收购Millipore)6 默克密理博提供三种PV

    26、DF膜: Immobilon PVDF 转印膜 Immobilon-P膜(0.45m)是一种 通用的基质,适用于一般的免疫印 迹应用。 Immobilon-P SQ 膜(0.2m)适用于 蛋白测序和低分子量蛋白的免疫印 迹。它有着更高的蛋白结合能力以 及比0.45 m膜更高的截留率。 Immobilon-FL膜(0.45m)是为荧 光免疫检测而开发的。它在多种激 发和发射波长范围内的荧光背景都 极低。 Immobilon转印膜以卷膜和方片膜 形式提供。预切好的膜与所有预制 胶以及大部分市售的凝胶电泳系统 兼容。Immobilon转印膜的性质详 见表2。表3列出了与最常用的电泳 系统相匹配的Im

    27、mobilon预切膜的 尺寸。表4列出了与现有的预制胶 相匹配的Immobilon预切膜的尺 寸。7 Sypro 印迹染料 Sypro 印迹染料 Immobilon-P 转印膜 Immobilon-P SQ 转印膜 Immobilon-FL 转印膜 描述 成分 PVDF PVDF PVDF 孔径大小 0.45 m 0.2 m 0.45 m 疏水性 疏水 疏水 低分子量 疏水 应用 Western印迹 Western印迹 Western印迹 结合分析 斑点/狭缝印迹 斑点/狭缝印迹 氨基酸分析 氨基酸分析 荧光免疫检测 N端蛋白测序 N端蛋白测序 质谱分析 糖蛋白观察 脂多糖分析 质谱分析 检测

    28、方法 显色 显色 荧光(最推荐) 显色 荧光 化学荧光 化学荧光 化学发光 化学发光 化学荧光 化学发光 放射性 放射性 蛋白结合能力 胰岛素:160 g/cm 2 胰岛素:262 g/cm 2 胰岛素:155 g/cm 2 BSA:215 g/cm 2 BSA: 340 g/cm 2 BSA: 205 g/cm 2 山羊 IgG: 294 g/cm 2山羊 IgG: 448 g/cm 2 山羊 IgG: 300 g/cm 2 兼容的可逆染料 透射法 透射法 透射法 丽春红 丽春红 丽春红 CPTS CPTS CPTS 甲苯胺蓝 甲苯胺蓝 Sypro印迹染料 兼容的不可逆染料 考马斯亮蓝 考马

    29、斯亮蓝 考马斯亮蓝 氨基黑 氨基黑 氨基黑 印度墨汁 印度墨汁 Colloidal gold Colloidal gold 表2. 常用Immobilon PVDF转印膜的特点和应用 适合从各种凝胶基 质上转移蛋白的高 效结合 孔结构均一,特别 适合分子量20 kDa 蛋白的结合 为荧光免疫检 测应用而优化8 制造商 垂直凝胶电泳槽 凝胶尺寸 (cm) Immobilon 膜的 尺寸 (cm) Immobilon-P 0.45 m 目录号 Immobilon-P SQ0.2 m 目录号 Immobilon-FL 0.45 m* 目录号 GE Healthcare SE 250 Mighty S

    30、mall 8 x 7 8.4 x 7 IPVH07850 ISEQ07850 SE 260 Mighty Small 8 x 9.5 8 x 10 IPVH08100 ISEQ08100 miniVE 8 x 9.5 8 x 10 IPVH08100 ISEQ08100 miniVE 10 x 10 10 x 10 IPVH10100 ISEQ10100 IPFL10100 SE 400 14 x 16 15 x 15 IPVH15150 ISEQ15150 SE 600 14 x 16 15 x 15 IPVH15150 ISEQ15150 SE 600 14 x 8 13.5 x 8.5

    31、IPVH08130 ISEQ08130 Bio-Rad Mini-PROTEAN 3, Mini-PROTEAN 3 Dodeca 8.3 x 7.3 8.4 x 7 IPVH07850 ISEQ07850 Criterion, Criterion Dodeca 13.3 x 8.7 13.5 x 8.5 IPVH08130 ISEQ08130 PROTEAN II xi 16 x 16 15 x 15 IPVH15150 ISEQ15150 PROTEAN II xi 16 x 20 26.5 x 375 IPVH00010 ISEQ00010 IPFL00010 PROTEAN II XL

    32、 19.3 x 18.3 20 x 20 IPVH20200 ISEQ20200 IPFL20200 PROTEAN Plus Dodeca 20 x 20.5 26 x 26 IPVH304F0 ISEQ304F0 Mini-PROTEAN II 8.3 x 7.3 8.4 x 7 IPVH07850 ISEQ07850 Invitrogen XCell SureLock Mini-Cell, XCell6 MultiGel 8 x 8 8.4 x 7 IPVH07850 ISEQ07850 Thermo Scientic P81 Pufn, P82 Wolverine, P8DS Empe

    33、ror Penguin 10 x 10 10 x 10 IPVH10100 ISEQ10100 IPFL10100 P8DS Emperor Penguin 8 x 10 8 x 10 IPVH08100 ISEQ08100 P9DS Emperor Penguin 16 x 16 15 x 15 IPVH15150 ISEQ15150 P10DS Emperor Penguin 20 x 20 20 x 20 IPVH20200 ISEQ20200 IPFL20200 表3. Immobilon PVDF预切转印膜和匹配的电泳系统9 预制胶名称 制造商 凝胶尺寸 (cm) Immobilon

    34、 膜的 尺寸 (cm) Immobilon-P 0.45 m 目录号 Immobilon-P SQ0.2 m 目录号 Immobilon-FL 0.45 m* 目录号 Bio-Rad Ready Gel 8.3 x 7.3 8.4 x 7 IPVH07850 ISEQ07850 Criterion 13.3 x 8.7 13.5 x 8.5 IPVH08130 ISEQ08130 PROTEAN Ready Gel 16 x 16 15 x 15 IPVH15150 ISEQ15150 PROTEAN Ready Gel 19.3 x 18.3 20 x 20 IPVH20200 ISEQ20

    35、200 IPFL20200 PROTEAN Ready Gel 20 x 20.5 26 x 26 IPVH304F0 ISEQ304F0 Cambrex PAGEr 9 x 10 8 x 10 IPVH08100 ISEQ08100 PAGEr 10 x 10 10 x 10 IPVH10100 ISEQ10100 IPFL10100 Gradipore MicroGel 8 x 2.5 8 x 10 (cut in 1/2) IPVH08100 ISEQ08100 igels 8 x 5.8 8 x 10 (cut in 1/2) IPVH08100 ISEQ08100 LongLife

    36、Gels 8 x 5.8 8 x 10 (cut in 1/2) IPVH08100 ISEQ08100 Invitrogen NuPAGE 8 x 8 8.4 x 7 IPVH07850 ISEQ07850 Novex 8 x 8 8.4 x 7 IPVH07850 ISEQ07850 Zoom 8 x 8 8.4 x 7 IPVH07850 ISEQ07850 E-Gel 13.5 x 10.8 13.5 x 8.5 IPVH08130 ISEQ08130 Thermo Scientic Precise Protein Gels 8 x 5.8 8 x 10 (cut in 1/2) IP

    37、VH08100 ISEQ08100 表4. Immobilon PVDF预切转印膜和匹配的预制胶 * 所有尺寸都可从Immobilon-FL卷膜(IPFL00010)上裁剪而成。 10蛋白结合 2 PVDF本质是一种疏水性的聚合物,在 水溶液中不会浸湿。为了在水性缓冲 液和系统中使用PVDF膜,首先必须将 其浸泡在50%(v/v)或更高浓度的醇溶 液中。甲醇、乙醇和异丙醇都适合浸 泡这种膜。随着膜的外观从不透明到 半透明,完全浸湿是显而易见的。之 后必须用水反复冲洗以去除醇类,经 预处理的膜现在可以直接放入转印缓 冲液中平衡。 Immobilon-P与Immobilon-P SQ 转印 膜之间

    38、的结合差异 一旦膜被浸湿,蛋白结合可通过蛋白 与膜的接触而实现。由于蛋白与膜的 结合贯穿整个膜的厚度(深度),结 合能力是由孔的内部表面积来决定的 (Manseld,1994)。Immobilon-P SQ 转印膜的内部表面积大约是 Immobilon-P转印膜的三倍,使其吸附 能力更高(表2)。表2中所列的数值 代表了膜表面在非变性缓冲液中饱和 后蛋白结合的上限。在任一指定的应 用中,都可以预期Immobilon-P SQ 转印 膜能比Immobilon-P转印膜结合更多的 蛋白。 然而,分析中可实现的最大结合能力 往往取决于所采用的具体操作步骤, 这是由于不同蛋白构象的差异,所使 用缓冲液

    39、的化学性质,以及样品上样 所用方法的限制等原因。 Immobilon-P与Immobilon-P SQ 转印膜之 间结合差异的例子如图1所示,蛋白样 品从聚丙烯酰胺凝胶上电转过来。部 分蛋白穿过Immobilon-P转印膜,被第 一张膜后面的第二张膜所捕获。相比 之下,所有蛋白与Immobilon-P SQ 转印 影响蛋白结合的因素 图1. 在分子水平上,蛋白吸附的效果至少 部分源于疏水氨基酸侧链与聚合物表 面疏水区的相互作用。Matsudaira (1987)观察到,在疏水残基被切割 之后,小肽的测序效率下降80%,这 可能是由于残余肽段被洗脱。同时, 在肽段消化降解时,人们也观察到疏 水肽

    40、段往往不能像亲水肽段那样高效 洗脱(如Iwamatsu,1991;Fernandez 等,1992)。McKeon和Lyman(1991) 指出,转印缓冲液中添加的Ca 2+ 离子 可增强钙调蛋白与Immobilon-P转印膜 的结合。钙的结合导致蛋白分子结构 中形成一个疏水带。 延长电转时间时Immobilon-P和Immobilon-P SQ 转印膜结 合蛋白的效果。分子量标准品(第1、3、5、7泳道) 和小牛肝裂解液(第2、4、6、8泳道)通过槽转印法 转移到Immobilon-P或Immobilon-P SQ 膜,并用考马斯 亮蓝染色。在第一张转印膜后再放一张Immobilon-P S

    41、Q 膜以捕获穿过的蛋白。(第5和6泳道在Immobilon-P 后面;第7和8泳道在Immobilon-P SQ 后面。) Immobilon-P kDa 200 1 2 3 4 5 6 7 8 Immobilon-P SQ Immobilon-P SQ 116 97 66 55 36 31 21.5 14.4 6 3.5 转印膜 转印膜 后备转印膜 膜结合,而未穿过。在这种情况下, 紧密的孔结构和聚合物较高的内部表 面积有助于所有转移蛋白的完全吸 附。不过,Immobilon-P SQ 转印膜上的 免疫检测可能产生较高的背景,需要 更严格的清洗条件。因此,膜的选择 是由实验目标决定的:对于2

    42、0kDa蛋 白的高灵敏度检测应使用Immobilon-P 转印膜,但如果分析较小的蛋白,或 必须捕获100%的蛋白进行肽段测序, 则首选Immobilon-P SQ 转印膜。11 3 滤纸 转印膜 转印方向 图2. 过滤印迹系统 在制备过滤法印迹时,请注意以下方面: 印迹方法:原理与优化 过滤(抽滤) 过滤是将蛋白上样到膜上的直接方 法。一个溶解的样品可以通过抽真空 而滤过膜。蛋白吸附到膜上,而样品 的其它组分则穿过膜(图2)。或者将 样品直接点在膜表面上,并让其干 燥。固定在膜上的蛋白随后可用于分 析。 斑点印迹(图3)和狭缝印迹是过滤方 法的两种形式,它们采用多联岐管装 置(manifol

    43、d),将样品以斑点状或狭 缝状上样到膜上。这些技术被作为快 速筛选大量样品的定性方法,或分析 相似样品的定量技术。它们在测试实 验设计参数是否适用于更复杂分析时 特别有用。 过滤方法的另一个形式是网格免疫印 迹。当样品量非常有限而无法用ELISA 等传统技术来开展分析时,这种技术 很有用,适合高度平行的样品分析。 例如,网格免疫印迹已用于过敏原特 异的抗体应答鉴定,只需要极少量的 患者血清即可完成分析(Reese等, 2001)。 去污剂会抑制蛋白吸附到膜上。样品 溶解和清洗所用的缓冲液中的去污剂 应不超过0.05%,且只在需要时添 加。 样品量应足够大,以覆盖每孔中暴露 的膜,但又不能超过膜

    44、的结合能力。 富含颗粒的样品可能会堵塞膜,而那 些高粘度的样品会降低流速。颗粒应 通过预过滤或离心来去除,并只将上 清上样到膜上。粘稠的样品应用缓冲 液稀释。 图3. 采用Immobilon Western 化学发光HRP底物在 人血清的斑点印迹上检测转铁蛋白(详见操 作步骤1.4 斑点印迹)。山羊抗转铁蛋白抗体 (稀释度1:10,0000)和兔抗山羊HRP结合的二 抗(稀释度1:50,000),在Immobilon-P膜上检 测连续稀释血清中的转铁蛋白,重复两次。 12 Western印迹包含下列步骤: 一个成功的Western印迹必须满足四个 要求: 在1-D或2-D凝胶上分离复 杂的蛋白

    45、混合物 Western 印迹 在聚丙烯酰胺凝胶上分离一个复杂 的蛋白样品。 将分离好的蛋白转移到膜上。 膜上特定蛋白的鉴定。 从凝胶上洗脱在转移过程中蛋白必 须从凝胶上洗脱。如果它仍保留在凝 胶上,则无法开展印迹分析。 吸附到膜上在转移过程中蛋白必须 吸附到膜上。如果蛋白不吸附,则无 法开展印迹分析。 处理过程中的蛋白截留在转移后的 印迹膜处理过程中蛋白必须仍然吸附 在膜上。 处理过程中蛋白的可及性吸附的蛋 白必须能与检测它的化学试剂接触。 如果蛋白被掩蔽,那它就无法被检 测。 在印迹之前分离复杂蛋白混合物最常用 的方法是一维(1-D)十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),

    46、其 中蛋白是根据其分子量分离的(图 4)。在某些情况下也使用非变性条件 来分离天然蛋白。尽管这种方法通常不 及变性电泳的分辨率,但是在一抗只识 别非变性蛋白或必须在膜上保留蛋白的 生物活性时,非变性电泳特别有用。 二维(2-D)凝胶电泳是分析细胞类 型、组织和体液中蛋白组成的理想技 术,也是蛋白组学的核心技术。2-D凝 胶的免疫印迹提供了分子量和等电点的 信息,在区分翻译后修饰所产生的蛋白 异构体上很有用(Celis和 Gromov, 2000)。在某些情况下,通过等电聚焦 的一维分离后的免疫印迹可实现蛋白分 型(Poland等,2002;Eto等,1990)。 二维印迹的例子如图5所示。 下

    47、列章节将讨论Western印迹中所涉 及操作的理论和实际经验。13 分子量标准品 图4. 图5. A 未染色胶的Western转印膜(半预染marker) B AP Western(AP偶联S-蛋白)的显色反应 C AP Western(AP偶联S-蛋白)的化学发光检测 100 A B C 225 225 kDa kDa kDa 150 100 75 50 35 25 15 150 100 75 50 35 25 15 16 15 凝胶中包含分子量(MW)标准品, 即marker,有助于在电泳分离后估计 感兴趣的蛋白的大小。目前有两种 类型的标准品,未染和预染。未染 的MW marker通常包

    48、含已纯化的、分 子量已知的天然或重组蛋白。观察 它们在凝胶或膜上的定位需要借助 一个染色步骤。 预染的MW-marker如图4所示。使用 预染marker既有优点也有缺点。但预 染marker可实现在电泳过程中监控凝 胶上的蛋白分离。它们也能指示后 续转印步骤中的转移效率。但预染 marker相对较贵,且染料的添加可能 影响蛋白迁移率。在确定分子量 时,预染marker也没那么准确,因为 蛋白上结合的染料会改变印迹过程 中它们吸附到膜上的能力。 Trail Mix蛋白标准品(目录号 70982)上带 有三个预染marker和八个未染marker(它们 都带有His Tag和STag),实现了电泳过程 中蛋白迁移的直接观察以及任一Western印 迹上准确的大小判定。 通过二维电泳分离的蛋白的化学发光检 测。大鼠成纤维细胞系的银染2-D凝胶 (左)和同一张凝胶的印迹(右),在 Immobilon-P膜上用小鼠单克隆抗体杂交, 并通过化学发光法观察。14聚丙烯酰胺的浓度 凝胶中聚丙烯

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