1、第 15 期收稿日期： 2009-05-28基金项目： 成都市科技计划项目，项目编号：07GGYB555GX-010第一作者简介： 肖世维，女，四川大学轻化工程 2006 级本科生，主要从事生物质化学与工程的研究 。* 通讯联系人： 从动物皮中提取胶原蛋白的方法肖世维1，但年华1，曾睿2*，林海1，胡帅1，但卫华1，米贞建3（ 1.四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065； 2.四川大学轻纺与食品学院，四川 成都610065； 3.成都佰乐金生物科技有限公司，四川 成都 610065）摘 要：综述了胶原蛋白的提取方法，阐述了提取条件对胶原蛋白结构的影响，探讨了不同胶原蛋白的
2、结构与性质之间的关系 。关键词：胶原蛋白；提取方法；结构；影响；研究进展中图分类号： TS 512 文献标识码： A 文章编号： 1671-1602（ 2009） 15-0017-05Extraction Methods for Collagen from PeltsXIAO Shi-wei1， DAN Nian-hua1， ZENG Rui2*， LIN Hai1， HU Shuai1， DAN Wei-hua1,MI Zhen-jian3(1.National Engineering Laboratory for Clean Technology of Leather Manufactur
3、e,Sichuan University, Chengdu610065, China;2.Institute of Light Industry， Textile and Food Enginerring, Sichuan University, Chengdu610065, China;3.Bai-Le-Jin Bio-Tech Ltd.Co,Cheng du 610065,China)Abstract: It was reviewed that different extraction methods such as acid process， alkaline process， enzy
4、meprocess and combination process for obtaining collagen. The extraction factors influencing the collagenstructure and the relationship between collagen structure and its properties were also discussed.Key words: collagen； extraction method； structure； effect； research progress1 引言胶原是生皮中最主要的纤维蛋白，是动物
5、皮肤的主要成分 。除此之外，动物的骨 、齿 、肌腱 、韧带 、软骨 、血管等组织中都存在胶原 。胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的 25%30%，在真皮蛋白质中，胶原占 85%90%1。胶原蛋白被广泛地应用于食品 、营养保健 、美容以及生物医学材料等诸多领域，胶原蛋白的提取一直是研究的热点 。迄今为止，胶原的提取方法主要有酸法 、碱法 、酶法和结合法 。随着高科技的不断发展，市场对胶原蛋白质的品质和档次提出了更高的要求，高产率生态化提取胶原已经成为必然的发展趋势 。本文综述了胶原蛋白的不同提取方法，综合分析了不同提取条件对胶原蛋白结构的影响，在此基础上，初步揭示了提取工艺方
6、法 、胶原蛋白分子结构与胶原蛋白性质三者之间的关系，提出了胶原蛋白高产率 、生态提取的新的理念和技术思路 。2 胶原蛋白的分子结构胶原蛋白的分子结构单元是原胶原 。原胶原为细长的棒状分子，由三条肽链构成1。每条肽链31 卷第 15 期2009 年 8 月西 部 皮 革WESTLEATHERVol.31 No.15Aug.200917西 部 皮 革 第 31 卷由 1000 个以上的氨基酸残基构成，不含色氨酸，其中脯氨酸是胶原特有的氨基酸 。胶原蛋白中甘氨酸 、脯氨酸 、羟脯氨酸含量高，不能形成 螺旋或 折叠片结构，而是形成以三条称为 肽链或 链的多肽链（亚基）缠绕成特有的三股螺旋2。虽然各种类
7、型的胶原蛋白都具有相似的螺旋结构特征，但组成胶原蛋白的各 多肽链的结构有很大的差别3。以I 型胶原为例，其一级结构，胶原中含有较为伸展的左手螺旋区段以及非螺旋区段，在螺旋区段中则呈现出了（ Gly- X- Y）n（其中 X，Y代表非甘氨酸）的周期性排列 。二级结构则由三条呈左手螺旋的肽链形成的右手大螺旋（如图 1所示） 。三股螺旋分子间以一定间距 、呈纵向对称交错排列形成原纤维，再聚集成纤维，然后形成更大的纤维束 。对于其他类型胶原的分子结构本文不作探讨 。3 胶原蛋白的提取方法提取胶原蛋白工艺过程大致为：除杂 、溶出 、纯化三个阶段，具体操作方式和控制条件因皮源的不同而有所差异4。在几种胶原
8、蛋白的提取方法中，酸法提取迅速而彻底，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，且产品得率低；碱法提取迅速且彻底，但含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用 (结构变异 )；酶法提取对胶原蛋白破坏性小，能更好 、更完全地得到活性蛋白，但水解不够彻底5。酸 、酶结合法相对于酸法溶解量提高 。此外，还有酸碱结合法，酸碱与热水结合法等 。3.1 酸法提取酸法提取是用酸浸泡预处理后的材料，再经离心等操作提纯的提取方法 。常用的酸有：乙酸 、盐酸 、草酸 、柠檬酸 、醋酸以及乳酸等 。酸法提取时，根据皮源的不同，所采取的工艺不同，其影响条件也不同 。叶易春等通过对酸法提取猪皮胶原分析得出：酸法
9、提取时，提取时间不同，其相对分子量及分布基本相同； pH 对相对分子量的分布也没有太大的影响；温度较高，相对分子量分布宽且呈弥散分布 。因此在酸法提取胶原时，应严格控制温度 。户业丽等6以酸法提取鲟鱼皮胶原蛋白，通过正交试验得出：乳酸较乙酸 、柠檬酸提取率高；随着乳酸浓度的增加，胶原蛋白的提取率也随之增加，但当浓度超过1 mol/L后，由于胶原蛋白变性导致提取率下降；在一定范围内浸提时间越长，胶原提取率增加越快，而后趋于平稳，最后还有可能会降低 。同样地，在一定范围内，温度提高胶原提取率增加，但一旦超过某一温度时胶原易发生变性导致降低；固液比小，胶原提取率低，固液比高，提取率增加不大 。其实验
10、得出对胶原提取率的影响程度：酸浓度 提取时间 温度 固液比 。酸法提取主要是利用在低离子浓度酸性条件下，破坏分子间盐键和Schiff 碱，从而引起纤维膨胀 、溶解，但是其溶解量很少7。研究发现，膨胀能力是胶原提取中的一个很重要的因素，因为它降低了胶原内部分子结构间的连接作用，打断非共价键连接使胶原打开8。因此，在酸法提取时，酸引起纤维的膨胀能力也是影响胶原提取难易的重要因素 。另外，其他研究者就不同的动物皮进行了研究，发现影响酸法提取胶原的因素以及影响程度也不同 。由此可见，在影响酸法提取的诸多因素中， pH 的影响不大，但 pH 值过小胶原大分子带正电荷，因电荷之间的排斥作用使胶原不能形成稳
11、定的凝胶；动物皮的种类以及对皮的预处理也是重要影响因素之一；酸的种类和浓度 、以及提取温度和时间影响都较大 。一般情况下，提取率随温度升高 、时间延长而提高，但时间过长或温度过高导会导致胶原变性从而使提取率降低 。3.2 碱法提取A电镜下胶原纤维呈明暗交替的条纹图案；B胶原纤维中原胶原分子的排列；C原胶原分子是一种右手三股螺旋；D三股螺旋中的每股链是左手螺旋；E三股螺旋的原胶原分子水平模型图 1 胶原纤维的结构A B C D E材 料 应 用18第 15 期碱法提取是用碱溶解预处理后的材料，从而达到提取胶原蛋白的目的 。预处理时除去皮中的脂肪 、污渍 、杂质等越好，就越有利于胶原蛋白的提取 。
12、已经有人以碱法提取皮革废弃物中的胶原蛋白，其中最关键的是脱铬 。碱处理法操作简便，脱铬率比酸法高，但采用该法只能得到相对分子量较小的胶原蛋白水解产物，应用价值并不太高9。与其他提取法相似，提取时间的延长在一定范围内可以使提取率增加 。有研究者将鱼鳞长时间浸泡在强碱溶液中，发现容易造成肽键水解，会使大量的胶原蛋白降解，部分氨基酸解离，导致提取率很低10。影响碱法提取的因素主要有碱浓度 、提取温度 、预处理 、pH 以及时间 。一定范围内提高碱浓度有利于提高胶原蛋白提取率 。一定范围内提高温度，有利于水解得到相对分子量较小的胶原产物，但超过范围会导致胶原的生物活性丧失 。在温度升高时，碱对胶原蛋白
13、的作用加强，肽键水解加快，胶原蛋白结构发生改变的可能性增大，温度过高将会破坏其三股螺旋结构 。随时间的延长，提取率曲线也会出现先升高后降低的趋势 。3.3 酶法提取酶法提取是在预处理后的材料中加入酶制剂，溶解材料，再经过其他操作提取胶原蛋白 。酶法提取常用胃蛋白酶 、木瓜蛋白酶以及胰蛋白酶等 。酶水解产物的分子集中分布在某些相对分子量范围，该特点有利于将皮水解产物开发成高附加值产品11。预处理一般是除去皮源中的不同杂物，如钙物质 、脂肪等，以便后续操作，得到更多更纯的胶原 。李国英等在通过优化预处理来提取胶原的研究中指出：对比而言，预处理主要集中在去钙上，因为那些无机物质中最主要的成分是钙，钙
14、会降低胃蛋白酶活性从而影响胶原提取率12。可见预处理对于胶原提取率的影响较大 。目前国内采用酶法提取胶原时的水解温度基本在 50 以上或 4以下，而胶原在 3738以上就会变性，生成明胶，故较高温度下的提取物为变性胶原，其进一步应用受到限制13。低温下虽然有助于胶原结构的完整，但酶解时间长 。提高酶解温度，有利于提高酶解速率，缩短酶解时间 。所得胶原纯度降低 、热稳定性减弱 、三股螺旋结构有一定程度的破坏，可能是因为温度升高后，胃蛋白酶中的少量胶原酶活性增加，开始作用于胶原螺旋区，从而导致相关特性的减弱14。当胶原蛋白在高于某一临界温度（变性温度）时，胶原的生物活性丧失 、溶解度降低 、不对称
15、性增高，其它一些物理常数也会发生改变，即产生了变性作用7。此变性作用是因为当温度升高到胶原蛋白的热变性温度以上的时候，胶原蛋白吸收的能量超过了分子间作用力，从而导致胶原蛋白三股螺旋链被破坏，三股螺旋链从伸展的纤维状态转变成无规卷曲状态 。三股螺旋结构对于胶原蛋白在医学方面的应用有很大的影响，因此应根据其应用特点选择相对合适的提取方法 。酶法提取的猪皮胶原就保持了完整的三股螺旋结构，这是胶原作为特种生物材料应用于生物医学领域的基础15。在特定的 pH 值 、温度等条件下，酶促反应的反应速率随着时间延长呈逐步变小的趋势 。在胃蛋白酶水解猪皮的过程中，酶作用底物的浓度随作用时间的延长逐渐降低，而胶原
16、产物的浓度逐渐升高并趋于稳定16。因此在酶法提取胶原蛋白时，应适当控制时间，不宜太长 。酶法水解提取胶原的影响因素主要有酶的用量 、水解 pH、水解时间 、以及水解温度17。酶法提取胶原的一般提取工艺为：预处理 酶解 盐析 透析 冷冻干燥14。用酶解法提取胶原蛋白是目前比较理想的手段，它具有反应快 、时间短 、对环境友好，提取胶原蛋白纯度高 、水溶性好 、理化性质稳定等特点18。3.4 结合法提取结合法是指将酸法 、碱法 、酶法及热水法等互相结合运用在提取胶原蛋白上 。结合法是现在很多研究者正在做的工作，以期通过此法克服各种单一方法的不足，得到高提取率的胶原蛋白 。Keiji Yoshimur
17、a 等以酸碱结合法提取胶原蛋白，先以碱预处理，再以酸提取 。当碱预处理时间缩短，酸浸提的胶原量就会减少 。与此相反，碱预处理时间越长，在预处理中胶原的损失就会增加19。酸碱肖世维，等：从动物皮中提取胶原蛋白的方法 材 料 应 用19西 部 皮 革 第 31 卷结合法提取的胶原产物稳定性较高，质量也较好 。潘杨等以酸碱法与热水浸提结合法提取鱼鳞胶，得到的胶原纯度高，品质良好 。其中料液比对其影响最小，而酸碱的浓度影响较大，呈现出先增大后减小的趋势；随浸酸时间延长，提取率先稍有下降后升高，再趋于平稳，最后降低20。4 胶原蛋白提取的影响因素分析胶原的来源不同，热稳定性也会有差异，这在一定程度上反映
18、出胶原中亚氨基酸（脯氨酸和羟基脯氨酸）含量的高低 。一般亚氨基酸的含量越高，螺旋越稳定21。因此，皮源不同，羟脯氨酸与脯氨酸含量不同，胶原稳定性不同 。含量越高，胶原越稳定，越难提取出 。性质依赖于结构，胶原的稳定性就是其特殊结构的外在表现21，胶原的结构及氨基酸组成决定了胶原蛋白结构的稳定性 。在各种氨基酸组成中，脯氨酸的羟基化程度有种属差异，生活在低温环境中的动物，其胶原蛋白上的脯氨酸羟基化程度较低，脯氨酸的羟基化对于原胶原单体之间形成氢键是必需的，因而对于原胶原三螺旋结构域的热稳定性具有相当大的作用22。影响胶原提取的因素有皮源 、预处理情况 、提取液浓度 、pH、提取温度 、提取时间
19、、有的还有提取液固液比 、提取工艺等 。这些因素都是相辅相成的，其中皮源是一个重要因素，皮源不同直接关系到胶原提取的难易程度，一般是根据不同皮源制定不同提取方案 。预处理是一个很重要的步骤，去杂 、去钙以及去脂等都对后续操作有较大的影响，很好地除去材料中的杂质有利于提高胶原蛋白的产率 。应适当控制提取液中酶 、酸 、碱的浓度，浓度过高的酸或碱，或者预处理时间过长都会导致胶体强度降低23。一定范围内提高提取温度提取率增加，但超过一定的范围反而降低，也容易导致胶原变性，因此应注意了解胶原的变性温度； pH 的影响会因皮源的不同而不同，当 pH高于或低于 pI 时，蛋白质分子净电荷残余物较多，由于链
20、间斥力溶解性增大（ Vojdani 1966），与之相对，若蛋白质分子间总净电荷为零，疏水基之间作用增强，从而导致在 pI 处聚集沉淀24。因此在溶解时，注意控制 pH 值 。适当延长提取时间也有利于胶原的提取，但过长，反而会使提取率降低 。因此，要得到高产率胶原蛋白，应该了解各种提取方法的影响因素，选择最优方案 。5 结束语近年来，随着科学的不断发展，皮胶原因其良好的生物活性，很多其他材料无法与之媲美，尤其在医学方面 。Eileen Gentleman等研究胶原在组织工程中的应用时指出，胶原在组织工程中的应用是一个很好的选择，它是具有很好生物降解性的天然材料，可以重建组织，最终在体内形成新的
21、胶原，代替原来的胶原25。在提取胶原蛋白时，提取方法应与胶原产品的最终用途相结合，有选择性地最大程度保留胶原蛋白某些方面的生物学性能 。总之，今后的胶原蛋白提取应该是继续朝着高产率 、清洁化的生态提取的方向发展，在了解各种不同的胶原蛋白提取方法的基础上，考虑其对环境的影响，将提取过程中所产生的对环境的影响因素降到最低 。此外，通过对高纯度的 、具有生物活性的胶原蛋白进行改性，获得高性能的生物医学材料，也将成为研究的热点和重点 。参考文献：1但卫华，程凤侠 .制革化学及工艺学M. 北京：中国轻工业出版社：2006.33-34.2胡帅，王慧桂，但卫华，等 .胶原蛋白结构的研究进展 J. 西部皮革，
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24、业园地 、焦点 观察 、译文 、行业新闻等 。为了突出重点报道内容，加强栏目建设，现征稿件：凡涉及皮化原材料 、皮化产品的研发 、技术进展 、应用技术 、市场现状及趋势分析均在征集之列 。欢迎致力于为皮革化工提供服务 、从事皮革化工产品研发 、营销的广大人士为本刊赐稿 。来稿请将第一作者简介（姓名 、出生年 、性别 、民族 、籍贯 、职称 、学位） 、详细通讯地址 、联系电话 、E- mail附于关键词后 。如论文系各类基金资助请一并注明 。另外，特别征集 “企业园地 ”栏目新闻线索 、稿件， “焦点 观察 ”栏目稿件 。来稿文责自负，请勿一稿多投 。每篇来稿编辑都将亲自回复 。稿件一经录用，
25、即付稿酬 。为了便于稿件分类和及时处理，来稿请投邮箱：。咨询 、投稿电话： 028- 86787311联系人：罗永娥（ 13683410635）征 稿 启 事!“!“!“!“西部皮革 编辑部(2): 563-567.9吕燕红，汤克勇，曹健，等 .从皮革废弃物中提取胶原蛋白及其在食品中的应用 J.皮革化工， 2003， 20(3)： 8-11.10刘晓宁，刘安军，曹东旭，等 .鱼鳞胶原蛋白的提取鉴定初探 J.食品研究与开发， 2007， 28(1)： 56-60.11胡胜，李志强，陈敏 .猪皮胶原的酶法提取 J.中国皮革， 2003， 32(5)： 6-9.12Li D, Yang W, Li
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