1、重组DNA技术,苏州大学生命科学学院朱 江 2006.8,重组DNA技术一、重组DNA技术发展史上的主要事件二、重组DNA技术相关概念三、重组DNA技术基本原理四、重组DNA技术与应用,分子生物学发展史上的三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。,重组DNA技术史上的主要事件,一、重组DNA技术相关
2、概念（一）DNA克隆克隆（clone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化（cloning）：获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。分子克隆（DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）,DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基因克隆或重组DNA。,1. 克隆的定义(the definition of cloning)： Clone-植物的无性系-在特定宿主中对DNA片段的操作-动物，包括人的无性繁殖2. DNA：包括载体(vec
3、tor)和外源插入片段(insert)3. 宿主(host)：细菌、酵母、昆虫、植物或动物细胞等4. 克隆的基本策略(Basic strategy of cloning) 原理：用一种或两种限制性内切酶切割载体DNA，然后 与外源DNA相连接，再用所得到的重组质粒转化宿主， 获得转化子。 关键：甄别与鉴定重组体,（二）工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶I逆转录酶DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶Taq DNA聚合酶,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）这些酶都是从原核生物中发现的，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。到1985年后己从350
4、多种不同微生物中发现了408种限制酶，识别108种不同的特定顺序，以内切方式水解核酸链中的磷酸酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH。,限制性核酸内切酶识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。 GGATCC CCTAGG ,限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end),5-端突出粘性末端3-端突出限制性核酸内切酶识别序列长度为48个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end），可用连接酶连接。,
5、（三）目的基因应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。1. cDNA(complementary DNA):是指经反转录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。2. 基因组DNA（genomic DNA）：是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有DNA序列。,（四）基因载体（vector）能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整DNA分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载 体。,载体的特点,能在宿主细胞中独立复制 有一定的选择标记（selection marker），易于识别和筛选 可容纳外源DN
6、A，而又不影响其本身的复制 有合适的限制酶切位点，以便于克隆,定义：能将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的工具,载 体 类 型,质粒载体 噬菌体载体 植物克隆载体 动物克隆载体 粘粒载体,1. 质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数 千碱基对。常有 1 3个抗药性 基因，以利于筛 选。,融合蛋白表达质粒载体pET-28a(+)、pET28a(-)长度为5.3kb-5.5kb，编码有一个卡那霉素抗性基因和一个lacI基因。 His-Tag和Thrombin位点pGEX载体长度约5kb，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacI基因，含有一个编码谷胱甘肽S-
7、转移酶(GST)的开放阅读框,其后有单一限制性内切酶位点(BamHI、SmaI、EcoRI),穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。,2.噬菌体（phage）DNA 噬菌体DNA改造系统 gt 系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）M13噬菌体DNA改造系统（含lac Z基因）M13mp系列pBluescript噬菌粒载体系统,pBlu
8、escript噬菌粒载体pBluescript是指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。,pBluescript SK（+/ -）噬菌粒载体的分子结构示意图。SK表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录；（+/ -）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBlu
9、esript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。,3.植物克隆载体,4. 动物克隆载体杆状病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒,4. 其他柯斯质粒（cosmid）酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,三、重组DNA技术基本原理,Colony/Transformant,（一）目的基因的获取1.化学合成法用于已知序列，或可推导出序列的基因2.基因组DNA基因组DNA文库（genomic DNA library） 3.
10、cDNAcDNA文库（cDNA library）4.聚合酶链反应（polymerase chainreaction, PCR）,基因组DNA文库存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G文库。,细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。,Electrophoresis pattern of genomic DNA,基因组DNA的部分酶切 Partial Digestion of Genomic DNA,cDNA文库用细胞总mRNA制备全套双链c
11、DNA后，建立的基因文库。简称cDNA文库。,反转录人工合成互补DNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题费时费事内含子序列,反转录人工合成互补DNA方法的优势 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因,用oligo(dT)合成cDNA Synthesizing cDNA by Using Oligo(dT),mRNA,mRNA-cDNAHybrid,nick,Reverse Transcriptase,RNase H,DNA Polymerase I T4 DNA Ligase,T4 DNA Polymerase for end-blunting,Double-strandedcDNA,
12、Nick Translation,用随机引物合成cDNASynthesis of cDNA by Using Random Primer,mRNA,mRNA-cDNAHybrid,Double-strandedcDNA,Reverse Transcriptase,RNase H,nick,DNA Polymerase I T4 DNA Ligase,T4 DNA Polymerase for end-blunting,Nick Translation,聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）PCR是根据DNA复制的原理，在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组
13、DNA或cDNA的专门技术。PCR的反应体系：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2的缓冲液。,PCR的基本反应步骤：1. 变性：将反应系统加热至95 ，使模板DNA完全变性成为单链；2. 退火：将温度下降至50左右，使引物与模板DNA退火结合；3. 延伸：将温度升至72 ，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经2530次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。,（二）克隆载体的选择根据宿主选择载体根据目的基因选择载体根据克隆目的选择载体,载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插
14、入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,（三）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接,2. 平端连接限制性内切酶作用产生的平端粘端经特殊酶处理变为平端3. 同聚物加尾连接由末端转移酶作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。4. 人工接头由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。,（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态导入方式：转化（transformation）转染（transfection）转导（trasduction）,遗传转化常用的方法,载体法转化农杆菌介
15、导法 基因的直接转移 （1）高压电脉冲电激穿孔 （2）基因枪法 （3）显微注射法 （4）花粉管通道技术,（五）重组体的筛选重组DNA导入受体菌后，经过培养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（screening）或选择（selection）。,1. 直接选择法：针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。其特点是直接测定基因或基因表型。,抗药性标记选择（插入失活法）：将目的基因插入带ampr和tetr基因载体的tetr基因中，则tetr基因失活。在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。,标志补救（marker rescue）若
16、目的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对营养素的依赖表型来筛选。,分子杂交法：利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。原位杂交Southern印迹,32P标记的DNA分子探针 、杂交、放射自显影法,DNA杂交直接鉴定,Southern凝胶转移杂交技术,2. 非直接选择法：免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。包括：免疫化学方法酶免检测法,（六）克隆基因的表达表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离、纯化,1. 原核表达体系E.coli的标准： 选择标志强
17、启动子翻译调控序列多接头克隆位点E.coli的不足： 缺乏转录后加工机制缺乏翻译后加工机制表达产物形成不溶性包涵体很难表达大量可溶性蛋白,2. 真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区积累缺点：操作技术难、费时、不经济转染：将表达载体导入真核细胞的过程,四、重组DNA技术与应用,农业：培养高产、优质、抗病虫和抗 逆境条件的动植物品种、克隆动物、转基因动植物作为生物反应器 健康：生物工程药物、基因治疗 、组织工程、器官移植 、 疾病诊断技术 环境：污染物处理、可降解塑料,转基因农作物（1）,1983 首例转基因植物成功
18、 1986 美、法首先进行大田试验 1997 全球转基因作物田间试验已达25000例，有51种转基因植物产品正式批准商业化生产,转基因农作物（2）,1996 全球种植 280万公顷 1997 1,250万公顷 1998 2,780万公顷 1999 3,990万公顷 2000 4,420万公顷 2001 5,000万公顷 2002 5,870万公顷 2003 6,770万公顷 已有16个国家允许种植，美国、阿根廷、加拿大和中国为四个主要种植国。 美国2003年种植的转基因大豆占80，棉花70，玉米38,转基因植物,抗病虫害、除草剂 耐旱、耐盐、耐低/高温 高产、优质 控制生长发育（花期、雄不育等
19、） 生物反应器 环境修复（phytoremediation）,转基因欧洲黑杨（P. nigra) 在新疆的环境释放(Bt),营养成分：蛋白质、油脂、淀粉和其他糖类、维生素等 延长储存期改良品味,品质改良,基因工程 改造水稻品质,可再生能源,地球上陆地和海洋生态系统中每年干有机质净产量约为14001800亿吨，其中陆地产量1100亿吨，占70。全球每年通过光合作用固定下来的太阳能（生物质能）约为人类全年全部能耗的10倍（41021 J）. 植物是生物质能的主要载体，微生物是生物质能转换的重要媒介。 能源植物：生物柴油、燃料醇（如酒精）、光合制氢。,医药产业产值,全球药品销售：1997 2200
20、亿美元预计： 2000 3300 亿美元2010 6000 亿美元国外大公司利润 27-35% 我国： 2000 2485.2 亿元2002 3430.8 亿元,我国生物医药产品现状,按销售额全国前50名公司中，前10位均为外资、合资 进口+合资 -60% 国产西药 95%为仿制 天然药物我国仅占全球不足10，中药出口额仅占世界市场3%，且大部分是原料出口,生物工程药物,全球四千多家生物工程公司的销售总额中，70为基因药物： EPO (Erythropoietin)红细胞生成素，促进红血球的形成美国Amgen公司每年生产3磅，每磅10亿美元（黄金价格的20万倍），从1989年投产以来，已为Am
21、gen带来超过100亿美元的利润。 Angiostatin鼠血清中分离获得，抑制肿瘤表面毛细血管的形成。抗肿瘤药物 人alfa-1b干扰素 疫苗：乙肝、霍乱、疟疾等,2003年销售额10亿美元以上的生物工程药物,摘自中国生物产业调研报告第818页,再生医学,研究和开发用于替代、修复、改善或再生人体各种组织器官 组织工程技术 干细胞和克隆技术 组织器官代用品 异种器官移植,器官移植（Transplantation）,Transplantation potential solution to a critical need,14 people die every day, 5000 people die every year in US alone, while waiting for an organ transplant.,Source: UNOS 1999,谢谢！,
