1、LS中 华 人 民 共 和 国 行 业 标 准粮油 检验 粮食中黄曲霉毒素的测定 快速高效液相色谱法Inspection of grain and oilsDetermination of aflatoxins in grains by fast high performance liquid chromatography（征求意见稿）LS前 言本标准针对粮食中主要污染真菌毒素之一-黄曲霉毒素的检测制定。本标准由全国粮油标准化技术委员会提出。本标准附录A是规范性附录。本标准起草单位：国家粮食局科学研究院本标准的起草人：粮油检验 粮食中黄曲霉毒素的测定 快速高效液相色谱法1范围本标准规定了采用免
2、疫亲和柱净化快速高效液相色谱法测定谷物及其制品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。本标准适用于小麦、玉米、大米、花生等粮食及其制品中黄曲霉毒素的测定。本标准方法黄曲霉毒素B1检出限为0.2 g /kg，黄曲霉毒素G1检出限为0.50 g /kg，黄曲霉毒素 B2、G2 检出限 为0.1 g /kg。2原理试样中的黄曲霉毒素用甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱净化，此抗体对黄曲霉毒素B 1、 B2、G 1、G 2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过配有荧光检测器的快速高效液相色
3、谱仪进行测定，外标法定量。3试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682中一级用水要求。3.1 试剂3.1.1 甲醇：色谱纯。3.1.2 乙腈：色谱纯。3.1.4 氯化钠：分析纯。3.2 试剂配制3.2.1 甲醇/水溶液（ 80:20）：量取80体积甲醇，加入20体积水，混匀。3.3 标准品黄曲霉毒素标准品（黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2）：纯度99%。或黄曲霉毒素有证溶液标准物质。3.4 标准溶液配制3.4.1 标准储备液：分别称取AFB 1、AFB 2、AFG 1、AFG 2标准品各0.1mg（精确至0.01mg ），用甲醇（3.1.1）溶解并定容
4、至10mL容量瓶中，得到浓度约为10g/mL的储备液。转移并密封后，避光-20保存，备用。3.4.2 混合标准溶液：准确移取适量的AFB 1、AFB 2、AFG 1 、AFG 2标准储备 液，加入甲醇定容，得到混合 标准液浓度分别为AFB 1和AFG 1：100 ng/mL，AFB 2和AFG 2：30ng/mL。密封后避光-20 保存，三个月内有效。3.4.3 混合标准工作液：准确移取适量混合标准溶液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，使溶液中AFB 1和AFG 1浓度为0.1-50 ng/mL、AFB 2和AFG 2浓度为0.03-15.0 ng/mL，再加入400L的超纯水，混匀后备用。避
5、光4 密封保存，有效期一周。3.5 材料3.5.1 黄曲霉毒素免疫亲和柱3.5.2 定性滤纸： 12 cm Whatman 4号1 ，或相当者3.5.3 玻璃纤维滤纸： 9 cm Whatman GF/A，或相当者3.5.4 滤膜：0.22 m孔径，有机相3.5.5 注射器：10mL 和20 mL4仪器和设备4.1 快速高效液相色谱仪：带大流通池荧光检测器和数据处理系统4.2 高速均质器1) 1 Whatman 4号为适合的市售 产品的实例 。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示本 标准对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，可经实验评估后使用这些等效的产品，下同。4.3 空气压
6、力泵4.4 天平：感量0.01 mg4.5 谷物粉碎机4.6 多功能振荡器4.7 泵流操作架4.8 离心机5分析步骤5.1 试样制备将大于1kg样品用谷物粉碎机磨细至粒度小于1 mm，混匀二次取 样，将试样装入洁净的容器内，密封， 标明标记，置于4下避光保存。用于检测。5.2 测定步骤5.2.1提取准确称取25 g(m，精确到0.01 g )试样，置于均质杯或250mL 磨口具塞三角瓶中，加入5 g 氯化钠和100 mL（V 1）甲醇/ 水溶液（80:20 ），高速均质提取2 min，或者使用多功能振荡器 200r/min振荡提取30min ，用定性 滤纸（3.5.2）过滤提取液或转移25ml
7、的提取液于50ml的离心管中， 5000r/min，离心5min 。取10 mL（V 2）滤液，加入40 mL（V 3）水稀 释，混匀后用玻璃微纤维滤纸过滤，备用。5.2.1 净 化将免疫亲和柱连接与20 mL注射器连接。准确移取20.0 mL（V 4）上述提取 滤液于注射器中，将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以1 mL/min 2 mL/min流速缓 慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气通过柱体。以10mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使部分空气通过柱体。准确加入1.0 mL（V ）甲醇（3.1.1）洗脱，流速控制为1 mL/min 2 mL/min，收集全部洗脱液于样品瓶中，准确移
8、取400L超纯水于样品瓶中，混匀后，过0.22 m滤膜（3.5.4），供液相色谱测定。*注：由于不同厂商提供的亲和柱操作程序可能有所不同，实际操作时，请参照免疫亲和柱厂商提供的操作说明和程序使用。5.3 测定条件5.3.1仪器参考条件色谱柱：C18 柱，50 mm3 mm，1.7m，或相当者。荧光检测波长：激发波长360nm；发射波长440nm 。流动相：A：甲醇，B：水。等度洗脱，A：B=40:60。流速：0.2 mL/min。柱温：25。进样量：2 L。5.3.2 标 准曲线 的制作在上述色谱条件下，等基线平稳后进样分析。用进样器吸取2 L黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、 G2标准工作溶
9、液（3.4.2）注入高效液相色谱仪进行分析，得到黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2标准溶液快速高效液相色谱图。参考 谱图见附录A 。以黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、 G2标准工作液 浓度为 横坐标，相对应色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，建立线性回归方程。5.3.3 试样 溶液的 测定用进样器吸取2 L样品溶液注入快速高效液相色谱仪进行分析。比较样品与标准的色谱图，根据保留时间定性。根据样品色谱图中黄曲霉毒素的峰面积用标准曲线定量，得到试样液中黄曲霉毒素的浓度 。用进样器吸取2 L流动相，按前步骤得出空白试样的浓度为 。1c 0c5.4平行 试样按以上步骤，对同一试样进行平行试
10、验测定。6结果计算样品中黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2的含量按式、计算：WVcX)(01其中：4321m式中：X1 样品中黄曲霉毒素 B1、B 2、G 1、G 2的含量，g/kg； 试样液中黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2的含量，g/mL ；c 空白试验黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2的含量， g/mL；0V 样液最 终定容体积，mL ；W 最终样 液所代表的试样质 量，g；m 试样称取量，g ；V1 样品提取液总体积，mL；V2 移取样品滤液的体积，mL；V3 用于稀释滤液的稀释液体积，mL；V4 通过免疫亲和柱的稀释后样品提取液体积，mL。计算结果表示到小数点后2位。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其它黄曲霉毒素B1检出限为0.2 g /kg，定量限为0.4 g /kg；黄曲霉毒素G1检出限为0.50 g /kg，定量限为1.5 g /kg；黄曲霉毒素B2、G2检出限为0.1 g /kg，定量限为0.3 g /kg。回收率为80%110%。附录A黄曲霉毒素标准色谱图图1黄曲霉毒素标准品的液相色 谱图
