LST - 粮油检测 粮食中伏马毒素B1、B2的测定 超高效液相色谱方法编制说明.doc

1、 1粮油检测 粮食中伏马毒素B1、B2 的测定 超高效液相色谱方法行业标准制定编制说明伏马毒素（Fumonisins）是一 组由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、多育镰刀菌(Fusarium proliferatum)、轮状镰刀菌（ Fusarium verticillioides）和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等产生的真菌毒素。迄今 为止，已经鉴定到28种伏马毒素类似物，它们被分为4组，即A，B ，C和P组 。B组伏马毒素是野生型菌株中产生量最丰富的，其中FB1占了总量中的70%左右，同时FB1也是所有伏马毒素中毒性最强的。可导致马产 生白脑软化症

2、（ELEM ）、神经性中毒，猪肺水肿，人类食管癌和肝癌等，国际癌症研究机构（IARC）1993年将其归为2B类致癌物。主要污染玉米及玉米制品，在大米、高粱、面条、啤酒中也有存在。目前报道用于伏马毒素检测的方法有酶联免疫法、免疫胶体金试纸法、时间分辨荧光免疫分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、薄层色谱法等。薄层色谱法由于操作复杂，目前应用较少；胶体金和酶联免疫方法用于快速筛查; 普通液相色谱方法目前应用较多，但分析速度较慢，耗费溶剂较多，成本增加；液质联用仪检测需要高端的质谱仪。当前急需建立一种更加灵敏、高效、低溶剂量的伏马毒素微量快速定量方法。为了满足当前我国粮食绿色检测、

3、监测定量分析的需要，通过查阅文献，根据范德米特(van Deemeter)方程理论，结合免疫 亲和净化手段，基于快速高效色 谱分离技术，建立了一种进样量小、分离度高、快速准确、环保的伏马毒素定量分析方法。本标准项目的研究有助于提高粮食样品检测、监测效率，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。本标准对后续标准制定，以及粮食污染黄曲霉毒素的相关科研、标准制定起到较好的指导、参考、促进作用。1工作简况1.1任务来源及起草单位根据2012年粮油行业标准制定计划的要求，由国家粮食局科学研究院负责粮油检测 粮食中伏马毒素B1、B2 的测 定 超高效液相色谱法起草工作，该方法也是国家863项目 “粮食产

4、后生物性危害物快速检验监测技术”（项目 编号2012AA101609）的研究内容之一。起草单位成立的标准起草组负责进行本标准的各项工作。1.2标准研制主要工作过程2（1）根据该标准的特点，2012年5月-2012年 7月，查询 了国内外资料，对相关检测机构、粮库、粮食加工企业进行了调研，并召开了第一次讨论会，确定了标准制订方案和工作计划。（2）2012 年8月-2012年 12月，在国家粮食局科学研究院实验室进行标准的研制工作，主要包括方法的建立，方法灵敏度测试，方法的线性范围确定，方法的回收率研究等。（3）2013 年1月-3月，编写了粮油检测 粮食中伏马毒素B1、B2的测定 超高效液相色谱

5、法标准草案，并召开了第二次讨论会。（4）2013 年4月-9月，在不同厂家的快速液相色谱上进行方法的验证。（5）2013 年10月-11月，标 准草案的意见征询。（6）2015 年3月-2015 年7月，行业验证。(7) 2015年8月 -至今，标准文本修改,形成送审稿。2标准的编制原 则和标准的主要内容2.1标准编制原则本标准是根据GB/T1.1-2009 标准化工作导则第1部分：标准的结构与编写规则、GB/T20001.4-2009 标准编写规则第4部分：化学分析方法的规定进行编制的。2.2确定标准主要内容2.2.1 标 准的适用范 围本标准规定了采用免疫亲和柱净化快速高效液相色谱法测定谷

6、物及其制品中伏马毒素的条件和详细分析步骤。本标准适用于小麦、玉米、稻谷等粮食及其制品中伏马毒素的测定。本标准方法伏马毒素B 1 、B 2的检出限为0.05 mg/kg。2.2.2 标 准研制的 总体思路2.2.2.1 仪器与试剂快速高效液相色谱仪：配备荧光检测器和数据处理系统。色谱柱：C 18柱（50 mm3 mm，1.7m, 或相当者）。黄曲霉毒素免疫亲和柱；玻璃纤维滤纸；0.22 3m有机滤膜；6 位泵流操作架；电子分析天平；高速旋转粉碎机；高速均质器；氮吹仪；多功能振荡器。伏马毒素B 1、B 2标准品，甲醇、乙 腈（色谱纯），超纯水。其它试剂和材料见标准送审稿。2.2.2.2检测波长的选

7、择实验过程中采用流动相作为背景溶液，用荧光检测器对伏马毒素B 1和B 2标准液在190600 nm进行 扫描（见图1 ）。结果表明，伏马毒素B 1和B 2最佳激 发波长为310 nm，最佳发射波长为435 nm、430nm。考虑到简化检测 条件，因此取激发波长为 310nm，发射波长为435nm。图1 伏马毒素B 1、B 2激发波长扫描谱图Fig. 1 FLR Excitation spectrum of FB1 and FB24图2 伏马毒素B 1、B 2发射波长扫描谱图Fig. 2 FLR Emission spectrum of FB1 and FB21.741.760FB1 -2.79

8、3.042. 4.127FB2 -5.19EU0.2.04.06.0 分0.51.0.502.02.50.0.50.0.505.05.06.06.507.0图3伏马毒素B 1和B 2的色 谱图Fig.3 Chromatogram of FB1 and FB22.2.2.3流动相的优化根据以上条件，参考“GBT 25228-2010 粮油检验 玉米及其制品中伏马毒素含量测定 免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光光度法”的流动相（ 见色谱条件），流速不同时，峰的保留体积基本相同，表明该流动相对FB 1和 FB2来说很稳定， 结果见表1 。表1 伏马毒素的保留体积（按FB2保留体积计算）Table 1

9、 Retention volume of FB1 and FB2流速 Flow rate 0.15ml/min 0.20ml/min 0.30ml/min 标准偏差STD相对标 准偏差 RSD （ %）保留体积Retention volume（mL ）1.0433 1.0438 1.1627 0.0688 6.45当流速为0.2 mL/min时，保留时间为5.22min，测1个样品消耗的甲醇量为：0.2 mL/min（流速） 5.22 min（保留时间）0.77（有机溶剂配比）=0.804 mL。目前国家标准(GBT 25228-2010)测 1个样品至少需16.1110.77=12.405

10、mL, 与之相比，本方法的有机溶剂用量是国标方法的1/12，流动相的消耗量少且环保。2.2.2.4方法的线性范围与 检出限在上述色谱条件下，用FB 1和 FB2的系列 标准溶液按选定的色谱条件测定，以UPLC测得的峰面积为纵坐标（y），相应的质量（ng） 为横坐标（x）绘制标准曲线，根据 3 倍信噪比的峰响应值，得出此方法检出限，根据10倍信噪比，得出 线性范围的下限，结果见表2 。表 2 FB1和 FB2的线性回归方程及检出限Table 2 Regression equations and detection limits of mycotoxins伏马毒素Fumonisins线性范围Lin

11、ear range(ng)线性方程 Linear equation 相关系数(R2) 检出限LOD(ng)FB1 0.2510.0 y=1.7058105x+1.1600104 0.9972 0.05FB2 0.2510.0 y=2.9780105x+1.6571103 0.9999 0.05目前现行国家标准GB/T 25228-201021给出普通免疫层析净化HPLC检测的检出限为1ng ，BILJANAF ABRAMOVIC等 22的研究的玉米中伏马毒素的高效液相色谱检测方法，检出限为0.5（FB 1）和1.3ng（FB 2）,与之比较，本方法的灵敏度至少提高了10倍。王 军淋等 23报道

12、的快速高效液相色谱检测玉米中的伏马毒素，其检测限为0.25（FB 1）和0.14ng （FB 2），也证明了快速高效液相色谱方法的高灵敏度。此外，灵敏度的提高，意味着可以减少用来进样分析的伏马毒素的量，在净化阶段可使用柱容量更小的免疫亲和柱。传统HPLC方法，由于灵敏度相对较低，需要柱容量较高的免疫亲和柱，要求填充更多的伏马毒素抗体，增加了分析成本，本方法允许使用容量更低的免疫亲和柱，从而也可降低检测成本。方法检测限为0.05 mg /kg.2.2.2.5方法的精密度与回收率将添加FB 1和 FB2的小麦、玉米样品按照本方法进行检测。同一批样品(FB 1 为5 g/g, FB2为2.5 g/g

13、)重复测7天，每天测7次，做方法精密度实验，本方法针对FB 1的日内精密度为2.2%，日间精密度为5.5%；FB 2的日内精密度为4.3%，日间精密度为7.4%，具有较好的精密度。添加FB1和 FB2的稻谷、小麦、玉米样品，每个浓度做5个平行样检测，测方法回收率，结果见表3。从表中可见， 表3 回收率实验结果Table 3 Recoveries of spiked samples with different fumonisins concentrations样品Sample添加量Spiked w(g/g)平均值Average value w(g/g)回收率范围Rang recovery R/

14、%小麦Wheat （FB 1）1/2/5 0.73/1.40/4.12 73.0/70.0/82.4小麦Wheat （FB 2 0.5/1/2.5 0.38/0.81/1.87 76.0/81.0/74.86）玉米Corn（FB 1） 1/2/5 0.75/2.01/4.52 75.0/100.5/90.4玉米Corn（FB 2） 0.5/1/2.5 0.48/0.91/2.11 96.0/91.0/84.4综合来看，本方法的灵敏度比其它高效液相色谱方法高，消耗的有机溶剂少，样品提取方法、回收率方面与其它高效液相色谱方法相当，具体情况见表5.2.2.2.6实际样品的分析应用建立的方法分析了来自

15、北京地区的40个玉米样品中的 FB1和 FB2，结 果表明， 样品中通常有一定的本底含量，部分样品有污染，结果见下表，样品色谱图见图4。从检测结果看，北京地区的伏马毒素污染风险不高。表4 玉米样品（FB 1+ FB2）检测结果Table 4 FB1+ FB2 of corn samples含量c（ g/kg） 未检出 0c1000 1000c2000 2000c3000 3000c4000 4000c占比（ %） 22.5 50 10 10 5 2.51.871.754FB -2.37FB2 -5.40EU051.0.52.0 分0.51.0.52.0.53.0.54.0.5.05.6.0.5

16、7.0.58.0.59.0.510.图4 FB1和 FB2污染玉米样品的色谱图Fig.4 Chromatograms of FB1and FB2 in contaminated sample of corn 2.2.2.7方法的验证本方法经北京市粮油食品检验所、河南国家粮食质量监测中心、湖南国家粮食质量监测中心、国家粮食局科学研究院检测中心等4家实验室验证。采用玉米谷物进行方法精密度实验。全部数据采用科克伦和格拉布斯（Grubbs）法检验，剔除离群值，根据情况 处理歧离值后，计算谷物及其制品中伏马毒素B 1、B 2的总体平均 值（m），重复性限（r ）和再现性限（R ），玉米中伏马毒素B 1、

17、B 2不同水平采取 4家样品检测值进行统计，这些结果均符合食品法典委员会程序手册（第二十版）中关于联合验证中HorRat在 2之内的规定。表5 实验室间联合验证统计结果（伏马毒素B 1）玉米参数水平1 水平2实验室数目 4 10参加统计实验室数目 4 107离群实验室数目 0 0平均值，m （ g/kg） 346.1 637.3 重复性标准偏差，Sr（ g/kg） 10.8 15.7 重复性限，r （ g/kg） 30.52 44.45 再现性标准偏差，SR（ g/kg） 26.5 24.6 再现性限，R（ g/kg） 75.1 69.6 HorRat值 1.16 0.64 表6 实验室间联合

18、验证统计结果（伏马毒素B 2）玉米参数水平1 水平2实验室数目 4 10参加统计实验室数目 4 10离群实验室数目 0 0平均值，m （ g/kg） 613.2 1498.7 重复性标准偏差，Sr（ g/kg） 11.9 89.0 重复性限，r （ g/kg） 33.74 251.92 再现性标准偏差，SR（ g/kg） 26.1 116.8 再现性限，R（ g/kg） 73.9 330.6 HorRat值 0.70 1.47 3采用国际标 准和国外先进标 准的情况，以及与国际、国外同类标准水平的对比，或者与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况本方法的检测灵敏度是普通HPLC方法的10倍；消

19、耗有机溶剂少，具有较高的精密度、回收率；检测时间短，从提取、净化到色谱分离，整个分析流程耗时不足45 min。实际样品检测表明，本方法能够满足对样品快速、高通量、低溶剂的检测要求。表7 快速高效液相色谱方法与其他液相色谱方法的性能比较Table 7 Comparison of the UPLC method and other HPLC methods reported recently in literature No. 基质Matrix提取净化Extraction/clear-up流动相/保留时间Mobile phase/retention time灵敏度Sensitivity （ng）回

20、收率RecoveryR/%参考文献Reference1 小麦、玉 免疫亲和柱，甲醇/乙 0.2 LOD值，FB 1 70.0100.58米 腈/水（1/1/2, v/v/v） mL/min，甲醇/0.1mol/ L磷酸二氢钠溶液（77/23, v/v）,6.184 min、FB 2均为0.052 玉米及其制品免疫亲和柱，甲醇/乙腈/水（1/1/2, v/v/v）1 mL/min，甲醇/0.1mol/ L磷酸二氢钠溶液（77/23, v/v）,16.11 minLOD值，FB 1、FB 2均为1 76.589.3 213 玉米、玉米饲料免疫亲和柱，甲醇/水（4/1 ，v/v ）0.8 mL/mi

21、n，甲醇/0.1mol/ L磷酸二氢钠溶液（77/23, v/v）,12.604 minLOD值，FB 1、FB 2均为1 74.085.5 244 玉米 离子交换树脂萃取，乙腈/水（1/1，v/v）1 mL/min，水/三氟乙酸（100/0.025， v/v），乙腈/三氟乙酸（100/0.025，v/v），梯度洗脱,17.22 minLOD值，FB 1、FB 2均为120 77.3102.6 255 玉米离子交换柱，乙腈-水(1/1, v/v)0.3 mL/min， pH 值为3.3左右的100 mmol/L甲酸 铵-甲酸溶液，9 minLOQ值，FB 1、为0.25、FB2均为0.14 7

22、5.690.0 236玉米原料的婴儿食品免疫亲和柱，甲醇/水（4/1 ，v/v ）1 ml/min乙腈/水/ 乙酸 (61/38/1 v/v/v)LOQ值，FB 1、为1、FB 2均为0.75 79 102 267 玉米和玉 米制品免疫亲和柱，甲醇/水（4/1 ，v/v ）1 ml/min乙腈/水/ 乙酸 (61/38/1 v/v/v),13.34minLOD值，FB 1为1、FB 2均为0.75 79 99.6 278 玉米强阴离子交换柱，甲醇/水(3:1, v/v)1 mL/min，甲醇/0.1mol/ L磷酸二氢钠溶液（77/23, v/v）,16 minLOD值，FB 1为1、FB 2

23、均为1.2；LOQ值，FB 1为2.3、FB 2均为2.7- 289 稻谷离子交换柱，甲醇/水(3:1, v/v)1 mL/min，甲醇/0.1mol/ LOD值，FB 1为0.4、FB 2均为0.440 80 299L磷酸二氢钠溶液（77/23, v/v）,17.6 min10 玉米免疫亲和柱，甲醇/乙腈/水（1/1/2, v/v/v）1 mL/min，甲醇/0.1mol/ L磷酸二氢钠溶液（78/22, v/v）,14 minLOD值，FB 1为0.5、FB 2均为1.3 88.7，90.5 224 与有关的现 行法律、法规和强制性国家标准、行业标准的关系本标准颁布实施后，针对粮食中伏马毒

24、素FB1、FB2的测定，符合现行的法律法规和强制性（国家、行业、地方）标准要求。5 重大分歧意见的处理经过和依据无。6 按照标准化法的有关 规定，提出强制性标准或推荐性标准的建议建议将本标准列为推荐性行业标准。 7 废止现行有关 标准的建议无8 其他应予说 明的事项标准采用了快速高效液相色谱仪Acquity UPLC（美国 Waters公司）， 荧光检测器（FLD ，美国Waters公司）和岛津公司的快速高效液相色谱仪LC-30A二元高 压梯度系 统进行了适应性研究，方法在 这两种仪器上结果符合要求。9 参考文献1 Rheeder J P，Marasas W F，Vismer H F. Pro

25、duetion of fumonisin analogs by Fusarium species. APPl Environ Microbiol，2002 ，68:2101-2105.2 Jeong-Ah S, RobertH P, Ronald D P.Characterization of four clustered and coregulated genes associated with fumonisin biosynthesis inFusarium verticillioidesJ. FungalGenet. Bio.l, 2001, 34: 155-165.3 Bezuide

26、nhout S C，Gelderblom W C A，Gorst-Allman C P，et al. Structure elucidation of the fumonisins，mycotoxins from Fusariom moniliforme. J Chem Soc Chem Commun，1988 ，743-745.4 Bhat R, Rai RV, Karim AA. Mycotoxins in food and feed:present status and future concerns. Compr Rev Food Sci F,2010, 9(1): 57-81.5 E

27、valuation of Certain Mycotoxins in Food, Fifty-sixth report of the Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives. World Health Organization: Geneva, 2002. 1-51.6 J.M. Soriano, S. Dragacci. Occurrence of fumonisins in foods. Food Research International 37 (2004) 9851000.107 Josep Rubert, JosMigue

28、l Soriano, Jordi Maes,Carla Soler. Occurrence of fumonisins in organic and conventional cereal-based products commercialized in France, Germany and Spain. Food and Chemical Toxicology 56 (2013) 387391.8 C. M. Lino . L. J. G. Silva . A. L. S. Pena . M. I. Silveira. Determination of fumonisins B1 and

29、B2 in Portuguese maize and maize-based samples by HPLC with fluorescence detection. Anal Bioanal Chem, 2006, (384): 12141220. DOI 10.1007/s00216-005-0295-z.9 ShuoWang, YingQuan, Nanju Lee, et a.l Rapid Determination of Fumonisin B1 in Food Samples by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Colloidal G

30、old Immunoassay J. Agric Food Chem, 2006, 54: 2491-2495.10 AlexandraMolinell,i KarinaGrossalber, RudolfKrska. A rapid lateral flow test for the determination of total type B fumonisins inmaize J. AnalBioanalChem, 2009, 395(5): 1309-1316.11 权英，詹月华，张根华，秦红，丁建英，王硕。伏马毒素B1酶标试纸条检测方法。食品研究与开发。2011,32（6）：97-1

31、00.12 张珏，朱岚，陈蕴，周彬，张艺，金坚，黄飚。伏马毒素 B1时间分辨荧光免疫分析超微量 检测方法的建立。环境与健康 杂志， 2009 年， 26 （12 ）：1112-1115.13 Eric W Sydenham, WentzelC A Gelderblom, PieterG Thie,l et al. Evidence for the natural occurrence of fumonisin B1, a mycotoxin produced by Fusarium moniliforme in corn J. Agric Food Chem,1990, 38(1): 285-

32、290.14 Lino CM, SilvaL JG, A Pena, eta.l Occurrence of fumonisins B1 and B2 in broa, typical Portuguese maize bread J. International Journal of Food Microbiology, 2007, 118(1): 79-82. 15 MarilenaMuscarella, Sonia LoMagro, Donatella Nardiello, et al. Development of a new analyticalmethod for the dete

33、rmination of fumonisins B1 and B2 in food products based on high performance liquid chromatography and fluorimetric detectionwith post-column derivatization J. Journal ofChromatographyA, 2008, 1203: 88-93.16 TeresaGazzott,i Barbara Lugobon,i Elisa Ziron,i et a.l Determination of fumonisin B1 in bovi

34、nemilk byLC-MS/MS J. Food Control, 2009, 20: 1171-1174.17 Josep Rubert, Carla Soler, Jordi Manes. Evaluation of matrix solid-phase dispersion (MSPD) extraction for multi-mycotoxin determination in different flours using LCMS/MS. Talanta 85 (2011) 206215.18 Schaafsma A W, Nicol R W, RottinghausG, et

35、a.l Analysis of Fusariumtoxins in maize and wheat using thin layer ChromatographyJ. Mycopathologia, 1998, 142: 107-113.19 Salisbury, J. J. Journal of chromatographic science, 2008, 46: 883886.20 Mather, J.; Rainville, P. D.; Spooner, N.; Evans, C. A.; Smith, N. W.; Plumb, R. S. Bioanalysis, 2011, 3:

36、 411420.21 中华人民共和国国家标准，GB/T 25228-2010 粮油检验 玉米及其制品中伏马毒素含量测定 免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光光度法。22 BILJANAF. ABRAMOVIC, SANDRAM. JAKSIC and ZORAN S. MASIC. Liquid chromatographic determination of fumonisins B1 and B2 in corn samples after reusable immunoaffinity column clean-up. J. Serb. Chem. Soc., 2005, 70 (6) 8

37、99 910.23 王军淋, 胡玲玲, 蔡增轩, 任一平。超高压液相色谱法同时检测玉米中的伏马毒素B1、B2 、B3。食品安全质量检测学报。2013年，4（1）：215-223.1124 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准，SN/T 1572-2005 进出口粮谷、饲料中伏马毒素检验方法 液相色谱法。25 Jiansheng Wang, Ying Zhou, Qiaomei Wang . Analysis of mycotoxin fumonisins in corn products by high-performance liquid chromatography coupled wit

38、h evaporative light scattering detection. Food Chem. 2008, 107, 970976.26 Liliana Silva, Mnica Fernndez-Franzn, Guillermina Font, Angelina Pena, Irene Silveira,Celeste Lino, Jordi Manes. Analysis of fumonisins in corn-based food by liquid chromatography with fluorescence and mass spectrometry detect

39、ors.27 C. M. Lino . L. J. G. Silva . A. L. S. Pena . M. I. Silveira. Determination of fumonisins B1 and B2 in Portuguese maize and maize-based samples by HPLC with fluorescence detection. Anal Bioanal Chem, 2006, (384): 12141220. DOI 10.1007/s00216-005-0295-z28 Ncediwe Ndube, Liana van der Westhuize

40、n, Gordon S. Shephard. Determination of fumonisins in maize by HPLC with ultraviolet detection of o-phthaldialdehyde derivatives. Mycotox Res, 2009, 25 (4):225228.29 Masayo Kushiro, Reiko Nagata, Hiroyuki Nakagawa, Hitoshi Nagashima. Liquid chromatographic detection of fumonisins in rice seed. Rep. Natl. Food Res. Inst, 2008, (72): 37-44. 30 GB2761-2011食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量31 GB/T 5009.1-2003食品卫生检验方法 理化部分 总则 32 粮食质量、原粮卫生和储粮安全检查办法(国家粮食局2006年7月25日以国粮检2006117号发布)