LST - 粮油检测 粮食中伏马毒素B1、B2的测定 超高效液相色谱方法.doc

1、ICS 点击此处添加中国标准文献分类号中 华 人 民 共 和 国 粮 食 行 业 标 准LS/T XXXXXXXXX粮油检测 粮食中伏马毒素 B1、B2 的测定 超高效液相色谱方法Inspection of grain and oilsDetermination of fumonisins B1、B2 in grains by ultra-high performance liquid chromatography点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施发 布XX/T XXXXXXXXX1前 言本标准按照 GB/

2、T 1.12009 给出的规则起草。本标准由国家粮食局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC 270）归口。XX/T XXXXXXXXX2粮油检测 粮食中伏马毒素 B1、B2 的测定 超高效液相色谱方法1 范围本标准规定了采用免疫亲和柱净化超高效液相色谱法测定谷物及其制品中伏马毒素的条件和详细分析步骤。本标准适用于小麦、玉米、稻谷等粮食及相关制品中伏马毒素的测定。本标准方法伏马毒素 B1 、B 2 的检出限为 0.05 mg/kg。2 原理试样中的伏马毒素经甲醇-水提取 , 提取液经过滤、稀释后，利用免疫亲和反应净化，以邻苯二甲醛柱前衍生伏马毒素为荧光化合物，用反相快速高效液相色

3、谱进行分离、检测，外标法测定伏马毒素B1 和 B2 的含量。3 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。3.1 试剂3.1.1 甲醇，色谱纯。3.1.2 乙腈，色谱纯。3.1.3 四硼酸钠，分析纯。3.1.4 氯化钠，分析纯。3.1.5 磷酸氢二钠，分析纯。3.1.6 磷酸二氢钾，分析纯。3.1.7 氯化钾，分析纯。3.1.8 浓盐酸，分析纯。3.1.9 乙酸，色谱纯。3.1.10 邻苯二甲醛（OPA） ，分析纯。3.1.11 2-硫基乙醇，分析纯。3.2 试剂配制3.2.1 0.1 mol/L 四硼酸钠溶液：称取 3.8 g 四硼酸钠（

4、3.1.3 ） ，用水溶解并定容至 100 mL。3.2.2 2 mol/L 盐酸溶液：将 1 体积浓盐酸（3.1.8）溶解在 5 体积水中。3.2.3 乙腈/水溶液（50:50）：取 50 体积乙腈（3.1.2）加入 50 体积水。XX/T XXXXXXXXX33.2.4 磷酸盐缓冲液（PBS）将 8.0 g 氯化钠（3.1.4） 、1.2 g 磷酸氢二钠（3.1.5） 、0.2 g 磷酸二氢钾（3.1.6） 、0.2 g 氯化钾（3.1.7）溶解于 990 mL 水中，用 2 mol/L 盐酸溶液（3.2.2 ）调节 pH 值为 7.0，最后定容为 1 L。3.2.5 1%乙酸水溶液：量取

5、 99 体积水，加入 1 体积乙酸（3.1.9） 。3.2.6 OPA 衍生液取 40 mg 邻苯二甲醛（3.1.10）加入 1 mL 甲醇溶解，加入 0.1 mol/L 四硼酸钠溶液（3.2.1）5mL稀释，加入 2-硫基乙醇（3.1.11 ）80 L，混匀。过 0.22um 滤膜后，存于具塞棕色瓶中，室温避光处可以储藏 1 周。3.2.7 2%乙酸化甲醇：量取 98 体积甲醇（3.1.1） ，加入 2 体积乙酸（3.1.9） 。3.3 标准品3.3.1 伏马毒素 B1 和 B2 标准品：晶体，纯度95% ；或伏马毒素有证溶液标准物质。3.4 标准溶液配制3.4.1 伏马毒素标准储备液使用伏

6、马毒素有证溶液标准物质；或准确称取适量伏马毒素 B1 和 B2 标准品（3.3.1） ，用乙腈/水（3.2.3）溶解，配制成伏马毒素 B1、B 2 浓度为 100 g/mL 的混合标准储备液。该标准储备液在 4下，可以稳定储藏 6 个月。3.4.2 伏马毒素标准储备液准确吸取适量伏马毒素 B1、 B2 标准储备液，用乙腈/水（ 3.2.3）定容，摇匀，获得伏马毒素B1、B 2 浓度为 10 g/mL 的混合标准液。3.4.3 伏马毒素标准工作溶液分别取适量伏马毒素混合标准液（3.4.2） ，用乙腈/水（3.2.3）稀释成 5 个浓度梯度的伏马毒素标准工作溶液。使溶液中伏马毒素 B1、B 2 浓

7、度为 0.1、0.25 、0.50、1.00 、2.00、5.00 g/mL。3.5 材料3.5.1 快速定性滤纸：12 cm Whatman 4 号 1，或相当者3.5.2 滤膜：0.22 m，有机系3.5.3 玻璃微纤维滤纸：9 cm Whatman GF/A，或相当者3.5.4 伏马毒素免疫亲和柱：对伏马毒素 B1 和 B2 均有 100%的交叉反应性3.5.5 玻璃注射器：10 mL 和 20 mL3.5.6 50mL 离心管4 仪器和设备1) 1 Whatman 4 号为适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示本标准对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效

8、果，可经实验评估后使用这些等效的产品，下同。XX/T XXXXXXXXX44.1 快速高效液相色谱仪：配备荧光检测器和数据处理系统4.2 天平：感量 0.01 mg4.3 谷物粉碎机4.4 空气压力泵4.5 氮气吹干仪4.6 高速均质器4.7 离心机4.8 多功能振荡器4.9 泵流操作架5 分析步骤5.1 试样制5.1.1 提取将样品用谷物粉碎机磨细至粒径小于 1 mm（全部通过 1 mm 孔径的试验筛） ，称取 25 g (精确到0.1 g )试样，置于均质杯中，加入 100 mL（V 1）乙腈/ 水（3.2.3） ，高速提取 2 分钟或者多功能振荡器3000 转/min，振荡提取 30mi

9、n，用定性滤纸（3.5.1）过滤或转移 25ml 的提取液于 50ml 的离心管中，5000r/min，离心 5min。取 1.5 mL（V 2）滤液，加入 35 mL （V 3）PBS 缓冲液（3.2.4）稀释，混匀，5000 r/min，离心 5min。5.1.2 免疫亲和柱净化将免疫亲和柱与玻璃注射器下端连接。将全部 36.5 mL（V 4）上述稀释液通过亲和柱，调节流速使其保持约 1 mL/min 2 mL/min，弃掉流出液。再分别以 10 mL PBS 缓冲液（3.2.4） 、10mL 水清洗亲和柱，直至液体完全流出，空气通过，弃掉全部流出液。分 3 次加入 1mL 酸化甲醇（3.

10、2.7）将亲和柱中的伏马毒素洗脱，控制流速为 1 mL/min 2 mL/min，收集洗脱液，55下用氮气吹干，测定前准确加入乙腈/水溶液（3.2.3） 500 L（V ）溶解残留物，过 0.22 m 滤膜（3.5.2） ，备用。*注：由于不同厂商提供的亲和柱操作程序可能有所不同，实际操作时，也可参照免疫亲和柱厂商提供的操作说明和程序使用。5.1.3 衍生化反应分别取上述净化液和标准工作溶液（3.4.3）各 100 L，置于带内插管的样品瓶中，加入相同体积的 OPA 衍生液，混合均匀后，静置 3 min，进样分析。5.2 仪器参考条件5.2.1 色谱柱：C 18 柱,50 mm3 mm，1.7

11、m,或相当者。5.2.2 柱温：30。5.2.3 流动相：A：1%乙酸水溶液（3.2.5） ，B ：乙腈（3.1.2） 。等度洗脱，A ：B=50:50。5.2.4 流速：0.2 mL/min。XX/T XXXXXXXXX55.2.5 进样量：2 L。5.2.6 荧光检测波长：激发波长 310 nm、发射波长 435 nm。5.3 标准曲线的制作在上述色谱条件下，等基线平稳后制作标准曲线。分别吸取伏马毒素各标准溶液进行衍生，3min 后进样分析，得到伏马毒素标准液相色谱图。参考谱图见附录 A。以标准工作溶液中伏马毒素浓度为横坐标，相对应的色谱峰峰面积为纵坐标，建立伏马毒素 B1、B 2 的标准

12、曲线。5.4 试样溶液的测定吸取样液进行衍生，3min 后进样分析。比较样品与标准品的色谱图，根据保留时间定性，根据峰面积用标准曲线定量，得到样液中伏马毒素 B1 或 B2 的浓度 。吸取流动相进行衍生，按前步骤进行1c分析得到空白试样的浓度为 。0c如果伏马毒素的浓度超过了所制作的标准曲线浓度范围，用乙腈/水溶液（3.2.3）将净化液稀释 f倍后，重新进行衍生化反应和色谱分析。6 分析结果的表述样品中伏马毒素 B1 或 B2 的含量，按式、(2)计算：WfVcX)(01其中：4321Vm式中：X1 样品中伏马毒素 B1、 B2 的含量，g/kg； 试样液中伏马毒素 B1、B 2 的含量，g/

13、L；c 空白试验伏马毒素 B1、B 2 的含量，g/L；0V 最终定容体积，mL；W 最终样液所含的试样质量， g；m 试样称取的质量，g；V1 样品提取液总体积， mL；XX/T XXXXXXXXX6V2 移取样品滤液的体积， mL；V3 用于稀释滤液的缓冲液体积， mL；V4 通过免疫亲和柱的稀释后样品提取液体积， mL；f 稀释倍数。计算结果表示到小数点后 2 位。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15%。8 其它伏马毒素 B1 、B 2 的检出限为 0.05 mg/kg，定量限为 0.25 mg/kg，回收率为 70%110%。XX/T XXXXXXXXX7附录 A伏马毒素毒素标准色谱图图 1 伏马毒素 B1、B2 标准品的液相色谱图