1、 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 全转录组测序引爆点 LncRNA/CircRNA创新研究策略及解决方案 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 生命体中的暗物质 1 RNA-seq之“暗物质 ” 解决方案 2 lncRNA与 circRNA的分析方案 3 目 录 CONTENTS 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 生命体中的暗物质 1 RNA-seq之“暗物质 ” 解决方案 2 lncRNA与 circRNA的分析方案 3 目 录 CONTENTS 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 非编码 RNA的分类 1.
2、 Housekeeping ncRNA tRNA, rRNA, snoRNA, snRNA Translation, ribosome mature, RNA splicingetc 2. Small regulatory RNA miRNA (21-24 nt), piRNA (26-31 nt), siRNA (20-25 nt DS) development and disease 3. Long noncoding RNA (lncRNA) 200 nt Most prevalent class of ncRNA XIST, HOTAIR development and disease
3、 (1) De Sacco et. al. Int. Journal of Mol. Sci. (2012), 13. (2) Taft et al., J Pathol 2010; 220: 126139, Non-coding RNAs: regulators of disease (3) Baker M. Long noncoding RNAs: the search for function. Nat. Meth. 2011;8:379383. 16,592个已注释的 ncRNA的主要分类 lincRNA, 5089 Antisense RNA, 3230 snRNA, 1944 mi
4、croRNA, 1756 snoRNA, 1521 miscRNA, 1187 uncategorized processed transcript, 933 other, 932 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 非编码 RNA的分类 1. Housekeeping ncRNA tRNA, rRNA, snoRNA, snRNA Translation, ribosome mature, RNA splicingetc 2. Small regulatory RNA miRNA (21-24 nt), piRNA (26-31 nt), siRNA (20-25 nt
5、DS) development and disease 3. Long noncoding RNA (lncRNA) 200 nt Most prevalent class of ncRNA XIST, HOTAIR development and disease (1) De Sacco et. al. Int. Journal of Mol. Sci. (2012), 13. (2) Taft et al., J Pathol 2010; 220: 126139, Non-coding RNAs: regulators of disease (3) Baker M. Long noncod
6、ing RNAs: the search for function. Nat. Meth. 2011;8:379383. 4. circRNA Intronic circRNA， Exonic circRNA miRNA Sponges / R BP Sponges Cancer + Neuroscience 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA的表达特征 与 mRNA相比 ， lncRNA一般表达量较低 ， 而组织特异性更强 Derrien et al, 2012, Genome Research Moran N. Cabili, GENES Cancer C
7、ell 2014 NATURE REVIEWS GENETICS 2014 Elife. 2014 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA 相对于 lncRNA 的特征 共价环化的 RNA环 细胞中 稳定性极佳 并且 半衰期较长 已知的 circRNA已有 150000个 线性的 RNA序列 细胞中稳定性不佳 已知的 lncRNA已有 100000个甚至更多 lncRNA的特征 circRNA的特征 多 miRNA结合位点 miRNA海绵机制 & 蛋白结合机制 生命体中的暗物质 1 RNA-seq之“暗物质 ” 解决方案 2 lncRNA与 circRNA的分析
8、方案 3 目 录 CONTENTS关于我们 ： 烈冰团队 4 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 如何设计一次 lncRNA的研究 课题设计与样本准备 测序与数据分析 后期功能验证 研究目标 ： circRNA， lncRNA？ Novel， Known？ 实验手段 ： Poly A（ +） ， Ribofree？ 样本选择 ： 生物学重复 ？ 采样位置 ？ 研究目标 ： 我的生物学表型是什么 ？ 分析手段 ： 我希望分析到什么程度 ？ 是否需要定制化的讨论和分析 ？ 深入分析 ： 是否需要分析最新的分析内容 ， 如 circRNA？ 研究目标 ： 我希望验证到什么程度 ？
9、 实验手段 ： 是否要补充一部分高通量测序的后期验证 ？ 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd ncRNA测序与数据分析流程 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 1.用 ribozero kit 去除 rRNA建库转录组寻找 可以获得更多的 ncRNA序列 ， 适合预测新lncRNA 同时获得 mRNA数据 2.polyA+富集建库 仅能获得 polyA+的 lncRNA 同时获得 mRNA数据 寻找已知的 lncRNA或者只是研究的一小部分 lncRNA测序分析策略 环状 RNA又如何 ？ 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circ
10、RNA测序与数据分析流程 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 1.用 ribozero kit 去除 rRNA建库转录组寻找 2.RNaseR去除线性 RNA序列 circRNA测序分析策略 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 历代发表文章的建库统计 更多的环状 RNA被检测 更准确的背景 与表达量的关系 Iju Chen, WIREs RNA 2016, 6:563579. doi: 10.1002/wrna.1294 生命体中的暗物质 1 RNA-seq之“暗物质 ” 解决方案 2 lncRNA与 circRNA的分析方案 3 目 录 CONTENT
11、S关于我们 ： 烈冰团队 4 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 研究策略 测序 质量控制 序列比对 预测新 lncRNA 预测新 circRNA 得到已知 lncRNA ncRNA对功能影响 ncRNA作用机制推测 circRNA/lncRNA 功能预测 得到已知 circRNA 新序列预测 测序数据处理 数据库功能推测 实验验证 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA数据分析研究 Known BioinformaOcs 2016 NONCODE PRIMARY DATABASES 1 GENCODE Encyclopdia of genes
12、 and gene variants hp:/www.gencodegenes.org/ (Derrien et al., 2012) 2 LNCipedia A database for annotated human lncRNA transcript sequences and structures. hp:/www.lncipedia.org/ (Volders et al., 2013) 3 lncRNAdb lncRNAdb is a database providing comprehensive annotaOons of funcOonal long noncoding RN
13、As (lncRNAs) hp:/www.lncrnadb.org/ (Amaral et al., 2011) 4 lncRNAMap FuncOonal Long Noncoding RNAs Database hp:/lncrnamap.mbc.nctu.edu.tw/php/ (Chan et al., 2014) 5 lncRNome lncRNome is a comprehensive searchable biologically oriented knowledgebase for long noncoding RNAs in Humans. hp:/genome.igib.
14、res.in/lncRNome/ (BharOya et al., 2013) 6 NONCODE 4.0 NONCODE provides an integraOve annotaOon of long noncoding RNAs. hp:/ (Xie et al., 2014) 7 The FuncOonal lncRNA Data- base repository of mammalian long non-protein coding transcripts that have been experimentally shown to be both noncoding and fu
15、ncOonal hp:/www.valadkhanlab.org/database (Niazi and Valadkhan, 2012) 8 NRED A database of long noncoding RNA expression hp:/ bin/ncrnadb.pl (Dinger et al., 2009) SECONDARY INFORMATION DATABASES 9 ChIPBase Database for annotaOng and exploring the expression proles and the transcrip- Oonal regulaOon
16、of lncRNAs and other ncRNAs. hp:/ (Yang et al., 2013) 10 DIANA- LncBase Experimentally veried and computaOonally predicted microRNA targets on long noncoding RNAs. www.microrna.gr/LncBase (Paraskevopoulou et al., 2013) 11 GeneCards v3 Integrated database of human genes that provides comprehensive, u
17、pdated, and user-friendly informaOon on all known and predicted human genes. www.genecards.org (Safran et al., 2010) 12 Linc2GO A human LincRNA funcOon annotaOon resource based on ceRNA hypothesis. hp:/ uke/Linc2GO/index.html (Liu et al., 2013) 13 lncPro PredicOon of lncRNA-protein interacOons hp:/2
18、02.38.126.151/hmdd/lncpro/ (Lu et al., 2013) 14 lncRNABase (starBase v2.0) A database consisOng of RNARNA and proteinRNA interacOon networks idenOed from 108 CLIP-Seq data sets generated by 37 independent studies. hp:/ A.php (Li et al., 2014) 15 miRcode Transcriptome-wide microRNA target predicOon i
19、ncluding lncRNAs hp:/www.mircode.org/mircode/ (Jeggari et al., 2012) 16 lncRNASNP Provides comprehensive resources of single nucleoOde polymorphisms (SNPs) in human/mouse lncRNAs. hp:/ SNP/ (Gong et al., 2014) DISEASE ASSOCIATION DATABASE 17 LncRNADisease A database for long-noncoding RNA-associated
20、 diseases. hp:/ (Chen et al., 2013a) 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA数据库 更好地注释 ， 更好地分析 ， 更好的结果 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA数据分析研究 Unknown 新 circRNA预测 新 lncRNA预测 Haas & Zody, Nature biotechnology, 2010 Transcriptome Reconstruc5on 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA数据分析研究 Unknown 新 circRNA预测 新
21、 lncRNA预测 1. Coding PotentialCoding Probability 200bp (Definition of lncRNA) 3. Exon Number 2 Optional 过滤已知 lncRNA 预测新的 lncRNA RACE扩增新lncRNA测序 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 新 circRNA预测 新 lncRNA预测 circRNA数据分析研究 Unknown 1. 可以发现新的circRNA的外显子连接形式 2. 可以发现新的circRNA存在区域（ Intergenic或者Intron区域 ） Iju Chen. Wile
22、y Interdiscip Rev RNA 2016 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA数据分析研究 Unknown 新 circRNA预测 新 lncRNA预测 ACFS FROM Xin5an You, Nature Neuroscience, 2016 1. Achieve the unmapped reads 寻找潜在的 circRNA的序列 2. Segmentation of the reads 将序列片段化后 ， 寻找片段化后能部分比对到基因组的序列 3. Identification of the circRNA 寻找前端在 RNA后端 ，
23、后端在 RNA的前端的序列 4. Expression将序列比对回 circRNA的转录本后重新统计表达量 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 烈冰 circRNA数据分析案例 新 circRNA预测 新 lncRNA预测 circRNA分类 circRNA长度 circRNA表达特异性 Circular RNA proling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging mulOple miRNAs 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 研究策略 测序 质量控制
24、 序列比对 预测新 lncRNA 预测新 circRNA 得到已知 lncRNA ncRNA对功能影响 ncRNA作用机制推测 circRNA/lncRNA 功能预测 得到已知 circRNA 新序列预测 测序数据处理 数据库功能推测 实验验证 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 核内 ncRNAs的功能 胞质 ncRNA 核内 ncRNA 充当增强子 enhancer (eRNA)招募 RNA 聚合酶 II 招募染色质修饰复合物 影响转录因子的招募 影响染色体的空间构象 影响 RNA的剪接 影响 mRNA的稳定性 影响 mRNA的翻译速率 作为 ceRNA竞争性结合 mi
25、croRNA 部分 lncRNA具有的短 ORF， 可以翻译成小肽 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 常见 circRNA分析方案 烈冰出品 circRNA鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 circRNA-mRNA共表达分析 核心 circRNA解析 核心 circRNA验证 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 circRNA-mRNA共表达分析 核心 circRNA解析 核心 circRNA验证 常见 circRNA分析方案 烈冰出品 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 circRNA-mRNA共表达分析 核心 circRNA解析 核心 circRNA验证 常见 circRNA分析方案 烈冰出品
