1、【干货收藏贴】WB 常见问题精品全集锦做了很久的 WB（western blot），走了很多弯路，但是 WB想要做好并不难，总结 WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。 WB常见问题分析1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？原因有很多：a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样
2、品放置时间过长。2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做 WB？a)可以选择 PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可；b)也可选择孔径 0.22um 的 PVDF 膜或者 NC 膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系。3.我的目的带很弱，如何加强？a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；b)也可以将一抗稀释比例降低；c)还可以延长曝光时间。4.DAB 好还是 ECL 好？DAB 有毒，但是比较灵敏，是 HRP 最敏感的底物；ECL 结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测 pg 级抗原
3、。5.胶片是一片空白，是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。a) 二抗的 HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM 底物中 H2O2，不稳定，失活；c) ECL 底物没覆盖到相应位置；d) 一抗选择不当二抗失活；e) 二抗失活。6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加 NaF 等？NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。7.细胞水平要做 WB，多少细胞提的蛋白够做 WB？一般 5106就足够。8.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载
4、30是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试 1.5mm 的。9.大分子量蛋白 200KDa，在做 WB 要注意什么？a) 做 200kd 蛋白的 WB 时要注意，分离胶最好选择7%的；剥胶时要小心；b) 转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。c) 转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高哦!10.免疫组化和 WB 可以用同一种抗体吗？免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空
5、间结构限制，煮后变性会消失。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。11.WB 中抗体的可以重复应用吗？抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用 23 次。稀释后应在 23 天内使用，4 度保存，避免反复冻融。12.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果？无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。WB 实验中常会出现各种问题，也跟技术菌们一起分享下 WB 实验中各种问题及应用对策，希望给您的实验带来实实在在的帮助WB问题汇总及
6、解决建议问题 原因 解决方案胶凝的不均匀，聚合不好 灌胶前将溶液充分混匀某些样品盐浓度较高 除盐或将样品盐浓度调成一致条带形状不好看 缓冲液陈旧，成分改变 重配凝胶下面有气泡 电泳前先将气泡赶走电泳时温度过高 降低电流或电压样品中含有不溶性颗粒 样品充分搅拌混匀电极不平衡或者加样位置偏斜 调整电极和加样样品上样量不足或目的蛋白浓度过低加大上样量或浓缩样品转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流抗体浓度低 增加抗体浓度或延长孵育时间封闭过度减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型显色剂失效更换显色剂（吸取 A、B 液
7、的枪头不可混用）显色或曝光时间不足 延长显色或曝光时间蛋白条带信号弱HRP 抑制剂所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠转膜缓冲液 pH 值与目的蛋白等电点相近提高转膜缓冲液 pH 值凝胶与膜之间存在气泡 转膜前要排尽气泡转印膜种类选择不当使用质量可靠的 PVDF 膜或硝酸纤维素膜电压或电流过小湿转时 20mA 恒流，半干转时 25V左右恒压转印时间过长或过短根据蛋白大小及转印装置选择合适的转印时间转膜效率低湿转过程中环境温度过高 使用预冷的转膜缓冲液或将装置至于 4 度选用的一抗、二抗及显色方法不合适选择合适的一抗、二抗和显色方法目的蛋白含量低于检测下限 加大上样量或浓缩样品抗体效价过低 增加抗体
8、浓度抗体孵育时间不足延长孵育时间，37C 孵育 1 小时以上抗体过度洗涤减少洗涤时间及次数，加入的去垢剂不宜过强或过多显色或曝光后无条带加入 HRP 底物反应与曝光检测之间间隔时间过长反应 3 到 5 分钟及时检测膜没有完全均匀湿透 使用 100% methanol 浸透膜洗膜不充分 增加洗液体积和洗涤次数封闭物用量不足提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜封闭物使用不当检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭封闭时间不够室温 37 度封闭 1 小时以上，4 度封闭过夜抗体非特异性结合 降低抗体浓度，减少孵育时间一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度一抗孵育的温度偏
9、高 建议 4结合过夜抗体浓度过高或洗涤不够降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间背景高 化学显色底物过多 按说明书加入适量的显色底物相对电荷 氨基酸电荷的组成胶浓度不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，调整浓度抗体孵育不充分 增加抗体浓度，延长孵育时间酶失活直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体查询相关文献确定蛋白条带位置（大小）不对标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低设置阳性对照比对结果，增加标本上样量目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际
10、大小样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作杂蛋白多 处理目的蛋白抗体特异性不强 使用特异性强的抗体抗体孵育时间过久 减少抗体孵育时间二抗与抗原有交叉反应 选择合适的封闭物二聚体或多聚体存在 增加蛋白质变性过程及强度杂带多 底物显色与曝光时间过长 缩短显色及曝光的时间膜孔径太小 更换孔径较大的膜转膜电压电流低 提高电压/电流转膜时间短 延长转膜时间大分子量WB 胶浓度太大 使用低浓度的胶转膜缓冲液配方不合适调整转膜缓冲液中甲醇及 SDS 浓度抗体与封闭试剂反应 使用前过滤封闭试剂背景有黑色斑点 HRP 偶联二抗中有聚集体 过滤二抗试剂，去除聚集体暗背景上白色带HRP 含量过高 降低酶联二抗的浓度背景有不均匀的白色斑点抗体分布不均匀 孵育抗体时使用摇床顺便给大家来几张在实验中的 WB 图
