1、有关物质（包括已知杂质）检查方法验证标准操作规程1.目的为保证检测工作的可靠性和可重现性，在未知样品的检测前必须对检测方法进行验证以证明所采用的检测方法适合于相应的检测要求。2.范围建立药品质量标准时、药品生产工艺变更时、制剂组分发生变更时、原分析方法修订时均应进行有关物质检测的方法学的验证。3.责任人检测员、项目负责人、各级项目经理：要求系统、全面验证含量测定方法并记录整理验证数据。4.程序4.1 验证内容：杂质检测方法的建立基于方法学研究，主要包括专属性试验、检测限试验、溶液稳定性试验等内容，如果定量 检测杂质则需进行线性、精密度、稳定性、重现性及回收率等试验，从不同的角度、层 面验证分析
2、方法的可行，从而保证药品中的杂质能够有效地检测。4.2 杂质检测方法建立验证及可接受标准1）专属性试验 主要通过破坏性实验实现。破坏性试验，也称为强制降解试验（stressing test），它是在人为设定的特殊条件下，如酸、碱、氧化、高温、光照等，引起药物的降解，通过对降解产物的测定，验证检测方法的可行性，分析药物可能的降解途径和降解机制。每项破坏性试验通常包括以下内容：酸降解一般采用 0.1mol/L1mol/L 盐酸或硫酸；碱降解采用 0.1mol/L1mol/L 的氢氧化钠溶液；氧化降解采用合适的过氧化氢溶液。以上三种试验，为了加快反应或者提高降解强度，必要时可以加热或提高浓度；高温试
3、验通常温度高于加速试验温度的 10，如 50、60等，对于原料药有时需考虑水溶液或混悬液的降解，或者考虑在不同的 pH 值条件下的降解；光照试验条件可采用 4500LX。破坏性试验的具体条件，与具体药物密切相关，需结合具体药物的特点，选择合适的条件，使药物有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义。药物经强力破坏产生的降解产物通常采用色谱法测定，需结合药物和可能降解产物的理化性质，选择不同的色谱方法（HPLC、GC、TLC）或检测器，有时可采用不同分离机理的色谱系统。下面以 HPLC 法分析降解产物为例，说明在进行破坏性试验时的关注点和存在的问题：在选定的破坏条件下，
4、药物应有一定量的降解。虽然不是每一种破坏性条件都使药物产生降解产物，但一般情况下，很少有一种化合物对每一种破坏性试验条件都稳定，因此，可以通过试验，选择合适的条件，如提高酸、碱、氧化的浓度或者通过加热等，使药物降解。对于采用 HPLC 法测定降解产物时，以主成分计算，一般降解 10左右。应采用有效的方法对降解产物进行检测，关注测定的回收量，通常应达到 90左右，证明检测方法的有效性。对于破坏性试验时降解量较大的降解产物，建议结合稳定性研究中加速试验和长期试验的具体杂质数据，参考 ICH 对新原料药中杂质的规定（每日服用最大剂量不超过 2 克时，鉴定阈值为 0.10；每日服用最大剂量超过 2 克
5、时，鉴定阈值为 0.05。），必要时进行定性分析，并作为已知杂质，根据安全性数据，采用已知杂质对照，确定合理的限度，订入质量标准。不能采用已知杂质进行对照时，可通过测定降解产物、主成分在测定波长处的吸收系数，分析两者的差异。若两者吸收系数相差较大时，建议采用响应因子校正后进行有效控制；如果两者吸收系数相差较小，建议采用自身对照法或峰面积归一化法进行有效控制。药物进行破坏性试验时通常降解为小分子物质，但也有发生聚合，形成聚合物，如 内酰胺类抗菌药物，在高温或高湿时有可能产生聚合物，故应采取有效方法进行检测。在这方面应避免的主要问题是：（1）主药完全降解，无法对降解产物进行有效检测；（2）由于选择
6、的降解条件强度不够，使药物未能降解，而误认为药物稳定；（3）不能选择合适测定方法，测定降解产物，使主成分降解后测定的回收量偏低；（4）未考虑破坏性试验时产生的聚合物；（5）选择的色谱流动相不合适，在图谱中有干扰峰。分离度与峰纯度分析破坏性试验产生的降解产物的个数比较多，采用 HPLC 法测定时，需考虑主成分与降解产物之间、降解产物相互之间的分离度，保证降解产物峰与主峰、降解产物峰之间有良好的分离度。另外，对于原料药，分离度符合要求也应考虑到主药与起始原料、各合成中间体是否有良好的分离度；对于制剂，应注意辅料、辅料降解产物的干扰。色谱条件的确定通常以最难分离的两个降解产物或降解产物与主成分之间的
7、分离度符合要求作为依据之一。鉴于降解产物检测时对分离度要求高，故推荐色谱分析时采用梯度洗脱，以有效分离降解产物。与分离度密切相关的是峰纯度分析。检测峰纯度通常采用二级管阵列检测器或者液质连用技术分析测定各色谱峰的纯度，说明在主峰中、各降解产物峰中有没有包含其它峰。简单地通过观察峰形判断峰的纯度没有说服力。对于创新药物的破坏性试验来说，峰纯度分析非常重要，一是可以了解降解产物的特性；二是可以有效地检出和控制杂质。存在的主要问题是：（1）主峰上出现明显的降解产物峰，测定方法不可行；（2）未对峰纯度进行有效分析，这是一种常见现象，在此情况下无法判断主峰中是否包含着降解产物峰；（3）对于制剂，未考虑辅
8、料降解对测定结果的干扰。检测灵敏度的考虑对破坏性试验产生的降解产物，通常考虑采取改变测定波长，来分析和检测降解产物峰个数和含量，确定合理的检测条件和方法。这也是测定波长确定的重要依据之一。必要时可采用不同机理的色谱系统检测降解产物。原则上讲，所选择的杂质检测方法应能测定破坏性试验中药物的每个降解产物（而且也考虑到起始原料、每个合成中间体的检出），从而达到对降解产物的控制，同时只有这样，才能保证有合适的回收量。目前在审评中发现存在的主要问题是仅提供主成分的检测限，以主成分的检测限作为测定波长确定的依据，而忽视对部分降解产物（包括起始原料和中间体）的检出，最终体现在降解的回收量达不到一定的要求，仅
9、有药物降解，没有降解产物检出。充分认识破坏性试验在杂质检测方法建立中的重要意义，建立科学合理的杂质检测方法，对于保证临床用药安全起着重要作用。以上为个人观点，仅供参考。2）检测限 杂质峰信号与噪音信号比应大于等于 3 时的量3）稳定性试验 取同一供试品溶液，于不同时间内测定，记录杂质峰面积（自身对照法为总面积） ，其 rsd%应小于 2.0%。4.3 已知杂质限度检查方法学验证方法及可接受标准1）准确度该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为 0.2%，则可分别配制该杂质浓度为 0.1、0.2
10、和 0.3的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算 9 个回收率数据的相对标准差（RSD ） 。该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在 80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至 70%-130%，相对标准差应不大于 15%。2）线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：在定量限至一定的浓度范围内配制 6 份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X） ，峰面积为纵坐标（ Y） ，进行线性回归分析。可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于 0.990，Y 轴截距应
11、在100响应值的 25以内，响应因子的相对标准差应不大于 10%。3）精密度1 重复性配制 6 份杂质浓度（一般为 0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得 6 份供试液含量的相对标准差应不大于15%。2 中间精密度配制 6 份杂质浓度（一般为 0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得 12 个含量数据的相对标准差应不大于20%。4）专属性可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于 2.0。5）检测限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 3。6）定量限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得
12、小于 10。另外，配制 6 份最低定量限浓度的溶液，所测 6 份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于 2.0%，峰面积的相对标准差应不大于 5.0%。7）耐用性分别考察流动相比例变化5、流动相 pH 值变化0.2、柱温变化5、检测波长变化5nm、流速相对值变化20以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于 2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于 2.0%，杂质含量的绝对值在0.1以内。8）系统适应性配制 6 份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%，保留时间的相对标准差应不大于 1.0%。另外，杂质峰的拖尾因子不得大于 2.0，理论塔板数应符合质量标准的规定。9）溶液稳定性按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（4）中，在1、2、3、5 和 7 天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。可接受的标准为：主成分的含量变化的绝对值应不大于 2.0%，杂质含量的绝对值在0.1以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。
