ELISA_技术的-操作要点.doc

1、ELISA 技术的-操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式 ELISA 各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球 ELSIA ，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。4.1 标本的采取和保存可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，体液（如血清） 、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液） ，有些则需经预处理（如粪便和某些

2、分泌物） 。大部分 ELISA 检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在 ELISA 中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP ，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA 中可使本底加

3、深。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于 4，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。4.2 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用 pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。

4、试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。4.3 加样在 ELISA 中一般有 3 次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在 LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法 ELISA ）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡 1 分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。4.4 保

5、温在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation) ，有人称之为孵育，在ELISA 中似不恰当。ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么 ELISA 反应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有 43、37、室温和

6、4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立 ELI SA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在 37经 1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在 43进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应 4更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在 ELISA 中一般不予采用。保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将 ELISA 板置于水浴箱中，LISA 板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保

7、鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA 板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25 ，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。4.5 洗涤洗涤在

8、 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在 ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗涤的方式除某些 ELISA 仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程如下：（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一

9、遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去） ；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置 1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作 c 和 d，洗涤 3-4 次（或按说明规定） 。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水

10、溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温 20，其浓度可在0.05%-0.2% 之间，高于 0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。（2）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗 2 分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡 2 分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。4.6 显色和比色

11、4.6.1 显色 显色是 ELISA 中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。OPD 底物显色一般在室外温或 37反应 20-30 分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD 底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止

12、反应。OPD 产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。TMB 受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。T MB 经 HRP 作用后，约 40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至 2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。4.6.2 比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正

13、确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准 96 孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔） ，以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD） ，现按规定用吸光度（absorbence，A） ，两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于 A 字母的右下角，如 OPD 的

14、吸收波长为 492nm，表示方法为“A492nm“或“OD492nm“ 。4.6.3 酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读 ELISA 结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到 0.0 01， 准确性为1%，重复性达 0.5%。举例说，若某孔测得的 A 值为 1.083，则该孔相对于空气的真实 A 值应为 1.083 0.01(1.0731.093 ） ，重复测定数次，其 A 值均应 1.0830.0

15、5（1.0781.088 ）在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在 0.0002.000，新型号的酶标仪上限拓宽达 2.900，甚至更高。超出可测上限的 A 值常以“*“或“over“或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为 0.0002.900，而其线性范围仅 0.0002.000，这在定量 ELISA 中制作标准曲线时应予注意。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在 1530，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。测读 A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波长。

16、有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1） ，第二次在不敏感波长（W2） ，两次测定间不移动 ELISA 板的位置。例如 OPD 用 492nm 为W1，630nm 为 W 2，最终测得的 A 值为两者之差（W1-W2） 。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书。4.7 结果判断4.7.1 定性测定定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出 “有“或“无“的简单回答，分别用“ 阳性“、“阴性“表示。“阳性“表示该标本在该测定系统中有反应。“阴性“则为无反应。用定性判断法也可得到半定量

17、结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法 ELSIA 中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法 ELISA 中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。（1） 间接法和夹心法这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在 ELSIA 中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而

18、异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本（ sample，S） 、阳性对照（P） 、和阴性对照（N）的吸光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。a 阳性判定值阳性判定值（cut-off value ）一般为阴性对照 A 值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照

19、品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测 HBsAg 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含 HBsAg 的复钙人血浆，阳性对照品 HBsAg 的含量标明为 P=92ng /ml。每次试验设 2 个阳性对照和 3 个阴性对照。测得 A 值后，先计算阴性对照 A 值的平均数（NC X ）和阳性对照 A 值的平均数（PCX） ，两个平均数的差（P-N）必须大于一个特定的数值（例 0.400） ，试验才有效。3 个阴性对照 A 值均应0.5NCX，并1.5 NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而

20、已另两个阴性对照重新计算 NCX；如有两个阴性对照 A 值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：阳性判定值=NCX+0.05 标本 A 值阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中0.05 为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生“试验无效“的后果。b.标本/阴性对照比值在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（ S）和阴性对照（N）的 A 值后，计算 S/N 值。也有写作 P/N 的，这里的 P 不代表

21、阳性(positive)，而是病人（pati ent） 的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用 S/N 表示。在早期的间接法 ELISA 中，有些作者定出 S/N 为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的 S/N 的阈值。更应注意的是，N 所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如 N90%为良好。符合率是综合灵敏度和特异性的指标。6.2 临床考核血清盘的制备要求1、采用人的原血清；2、血清盘应具有相应的稳定性；3、血清盘中样本不含防

22、腐剂，或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂；4、血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半；5、阳性样本中，应有一定数量的强阳性和弱阳性样本；6、血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品，以检验试剂的灵敏度。7、血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质（RF 因子）的样本，以检验试剂的特异性。6.3 临床考核血清盘的建议以抗 -HBc-IgM 为例，部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本，经美国 abbott 公司抗-HBc-IgM 试剂反复检验筛选。选出血清 70 份，其中阳性 29 份，阴性 41 份，组成抗-HBc-IgM 临床考核血清盘。在 70 份样本中，除

23、7 份为无病历的质控血清外，抗-HBc-IgM 阳性的 22 份样本中含临床诊断急性肝炎 16 例、慢性活动性肝炎 5 例、重症肝炎 1 例；抗-HBc-IgM 阴性的 40 份样本中，含临床诊断慢性迁延性肝炎 24 例、急性肝炎例（均为恢复期采的血样） 、慢性活动性肝炎 8 例（其中 5 例为恢复血样） 。因此，这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核，可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开，具有临床诊断意义。质量管理ELISA 是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以

24、做定性试验也可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域。ELISA 的影响因素较多，加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。分析前质控人员培训实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：检验项目的基本原理（ELISA 原理） ；临床意义；熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成） ； 熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。某些特殊项目的检测如抗 HIV 等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。分析前质控ELISA 原理：1971 年 Engval

25、l 等人把免疫组化的 EIA 技术应用于临床检验发展为ELISA 技术。特点：在固相表面组装免疫活性物质形成“免疫吸附剂“ 酶标记免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高。局限性：只能检测到 ng 水平精密度差（批内 CV15-20%） ； 线性范围窄（一个数量级） ；存在“HD-HOOK“ 效应。ELISA 原理根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方法。双抗体（原）夹心法检测抗原（体）的常见方法，应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载体和酶标抗体检测溶液中的抗原（适用于二价以上抗原,不能测小分子半抗原） 。间接法检测抗体的方法，利用酶标记的抗抗

26、体（第二抗体）检测已与固相抗原结合的抗体。竞争法检测抗原或小分子半抗原、抗体，以测抗原为例，使待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。ELISA 今后的发展方向聚苯乙烯表面的高级制备。已有的技术是酰肼化（聚二氟乙叉，PVDF） ；生物素化；预包被多聚赖氨酸等，均是专利产品。酶促信号放大的改变，如酶促荧光、酶促化学发光等。ELISA 临床意义各型肝炎的特征及标志物乙肝二对半的模式及临床意义HBsAg HBeAg HBcAb-IgG HBcAg-IgM HBeAb HBsAb 临床意义+- 急性 HBV 感染早期 HBV

27、 复制活跃+ +- 急慢性 HBV 感染，HBV 复制活跃+-+ +- 急慢性 HBV 感染，HBV 复制中跃+-+ +- 急慢性 HBV 感染，HBV 复制低跃+-+ -+-HBV 复制停止或极低-+ +- 平静的 HBV 携带状态，HbsAg -+ -HBV 既往感染，未产生抗-HBs -+ +-抗 HBs 出现前期，HBV 复制低-+ -+HBV 感染恢复期-+ -+HBV 感染恢复期+ +-+ 不同亚型再感染+-整合- 病后或接种疫苗后获得免疫 试剂盒选择卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格，并贴有防伪标签的产品，试剂应从灵

28、敏度，特异性，精密度，稳定性，简便性，安全性及经济性作出全面的评价。灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力（假阴性越少越好） ，取决于包被物的全面性。特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力（无假阳性） ，取决于包被抗原（体）及标记抗原（体）的纯度及特异性。精密度：ELISA 试剂一般指其批内 CV，其值应小于 15%；定量试剂应同时考察线性范围试剂盒选择稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间，一般采用破坏性试验即将试剂存放于 37保存，定期测定其灵敏度，特异性和精密度等指标，直到其质量指标开始下降为止，通常认为 37每稳定一天相

29、当于 4-10 保存一个半月。简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性试验中结果判断简单明了， ）定量试验结果计算也应简单。安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本而市场价格比较合理。试剂盒评价试剂评价需要有权威的血清考核盘（ Panel）进行检测，一般实验室不易从生检所或临检中心取得，每进一次试剂评价一次也很麻烦。可以通过间接的信息对试剂进行选择。根据该试剂生检所批批检定报告，了解其质量水平，按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂；通过询问试剂包被物的组成，如原料来源（基因工程或合成多肽）

30、 ，片段的组合（按比例混合或化学合成） ， 片段的长短等判断试剂的优劣；参考室间质评评价报告中对试剂的评价结果，这比较客观公正，因为统计数字均来自各参评医院，反映了试剂在某一地区的使用情况；根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。仪器质控为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP） ，所要控制的仪器包括移液器（加样枪） ，水浴箱（温箱） ，洗板机和酶标仪。移液器：ELISA 加样量小（5-100l） ，其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在10%以内；水浴箱经常检查水浴箱温度计所示的温

31、度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有1的误差；洗板机每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过 2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；酶标仪经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。附 1：酶标仪校正程序滤光片波长精度检查：将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下，用 UV-2201 型紫外-可见分光光度计（波长精度0.3nm）于可见光区对每个滤光片进行扫描，其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。通噵差与孔间差检测：通道差检测是取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑，透明，无污染以酶标板架作载体，将其（内含 200ul 甲基橙溶液吸光度调至 0.5

32、00A 左右）置于 8 个通道的相应位置，蒸溜水调零，1 于 490nm 处连续测三次 ,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示。孔间差的测量是选择同一厂家，同一批号酶标 2 板条（8 条共 96 孔）分别加入 200ul 甲基橙溶液（吸光度调至 0.100A 左右）先后置于同一通道，蒸溜水调零,于 490nm 处检测，其误差大小用1.96s 衡量。n 零点飘移（稳定性观察）：取 8 只小孔杯分别置于 8 个通道的相应位置，均加入 200ul 蒸溜水并调零，于 490nm 处每隔 30 分钟测一次，观察各个通道 4 小时内吸光度的变化。精密度评价：每个通道 3 只小杯分别加入

33、 200ul 高中低 3 种不同浓度的甲基橙溶解，蒸溜水调零，于 490nm 作双份平行测定，每日测二次（上下午各一次） ，连续测定 20 天。分别计算其批内精密度，日内批精密度,日间精密度和总精密度及相应的 CV 值。线性测定：用电子天平精确称取甲基橙配制 5 个系列的溶液，于 490nm 平行测 8 次，取其均值。计算其回归方程，相关系数及标准估计误差 s，并用1.96s 表示样品测量的误差范围.双波长测定评价：取一分甲基橙溶液，分别加入 3 种不同浓度的溶血液（测定波长为 490nm，校正波长为 585nm） ，先后于 8 个通道检测，每个通道测 3 次，51 比较各组之间是否具有统计学

34、差异，以考察双波长消除干扰组分的效果。一般酶标仪无 585nm 滤光片，可选用 550nm 或 630nm 滤光片。450nm 滤光片的检定选用普鲁兰溶液（校正波长为 630nm） 常见酶标仪评价标本的采集和保存可用作 ELISA 的标本十分广泛，体液（如血清，血浆，各种积液） ，分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成分，一般使用血清。n 标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，可造成假阳性；长菌的标本同样的道理易产生假阳性。抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。标

35、本在冰箱中保存时间过长易导致血清 IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置 4冰箱 5 天内完成测试。如需保存一周以上则要-20冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。ELISA 的灵敏度1ng/ml 水平上,标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本.最起码应先做免疫后做生化. 附：内外干扰物质的影响分析溶血脂浊 RF 自身抗体 AFP 补体 肝素; EDTA A 0.165 0.200 0.250 0.264 0.186 0.146 0.183 0.126 S 0.023 0.016 0.007 0.029 0. 010 0. 007 0.019 0.013

36、A 对照 0.151 0.195 ;0.195 0.195 0 .116 0.116 0.116 0.116 S 0.038 0.008 0. 008 0.008 0.018 0.018 0.018 0.018 P 0.05 0.05 2.1 换算而来，常用于夹心法。B） C.O=0.5N，从抑止率公式换算而来，常用于竟争，中和法C） C.O=N+C（C 为常数） ，用于间接法。D) C.O=CP+N（C 为常数） ，用于间接法。此公式最客观，但对生产厂家要求很高，阴阳性对照测定值要基本恒定。报告方式定量分析用已知量的标准品作一系列稀释，ELISA 测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示。

37、ELISA 的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。现有的 ELISA 定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线，要得到精确的结果实属不易。因此严禁用定性试剂盒做定量分析。灰区概念把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将 CO 值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性） 。灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。灰区的设置有二种：1）C.O（1CV） ， CV 为该试剂的批内 CV (一般在 15-20%间） ； 2）C.O2s，s 为实验室做室内质控 ROC 的 s 。高值钩镰效应（HD-HOOK）在二位点夹心

38、 ELISA 中，其剂量反应曲线的高剂量（HIGH DOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK） ，MILES（197 4）根据此现象写实性地称之为“HD-HOOK“ 效应。产生该现象的分子机理有“分子变构说“和“浓度效应“等推论。一步法和二步法均存在，只是前者出现的更早些，大多数是高值低吸光度，很少阴性结果。质量控制（Quality Control，QC） 英国 Whitehead 教授建议生化检验工作的质量控制分为 4 个步骤：最佳条件的变异（OCV） ；常规条件的变异（RCV） ；病人结果的统计（SPR） ；室间质量控制（EQA）

39、。前三个步骤即室内质量控制（IQC） 。在 GLP 概念里 QC 即指 IQC，其定义为：由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本室工作的可靠性，旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高批内批间样本检验的一致性，以确定检验报告是否可靠或可否发出的一项工作。免疫测定方法的灵敏度和特异性要比生化方法高得多，因此 QC 手段不能照搬生化模式。分为定性和定量二个方面。质量控制（Quality Control，QC） 定性试验：ELISA 定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此 QC 要保证试验的灵敏度和特异性。生化的质控图方法仅能观察灵敏度而无法监控特异性。建议使用临界值血清

40、界定法：将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应；另设临界值、高值质控血清，正常人血清作为外对照，与标本同时检测，临界值 S/C.O1，高值质控血清 S/C.O10，正常人血清 A 值在 0.050.07 之间。阳性质控血清失控（临界值为灵敏度，高值为“HOOK“ 效应监控）应重做阴性标本；阴性对照失控应重做阳性标本。以表格式记录每块板的外对照实验结果，作为 QC 资料存档。质量控制(Quality Control) 定量试验： ELISA 定量试验常见于肿瘤因子（如 AFP，CEA，CA 系列） ，激素类，免疫球蛋白类，这些物质在体内有一定的量（正常范围） ，超出这个量才呈病理情况，故需定

41、量测定。定量试验的质控方法可参考生化方式。质量控制(Quality Control) “即刻性“质控：在开始进行质控时，只需要有 3 个质控血清测定值即可进行质控。当这组数据扩大到 20 次有效值时就可以计算 RCV 的 X，s。方法：（1）先将测定值从小到大排列，X1 最小，Xn 最大；（2）计算 X 和 s； （3）计算 SI 上限值和下限值。SI 上=（X 最小-X）/S， SI 下=（X 最大-X）/S 对照 SI 表，检查是否出控，SI 上、下限规定值，在控；SI 上或下限规定值，失控。质量控制(Quality Control) SI 值表（即刻性质控）N 3 4 5 6 7 8 9

42、 10 11 N(3s) 1.15 1.49 1.75 1.94 2.10 2.22 2.32 2.41 2.48 N (2s)1.15 1.46 1.67 1.82 1.94 2.03 2.11 2.18 2.23 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2.55 2.61 2.66 2.71 2.75 2.79 2.82 2.85 2.88 2.29 2.33 2.37 2.41 2.44 2.47 2.50 2.53 2.56 室内质控血清的制备：收集阳性血清(无明显溶血、黄胆、脂肪血和污染血清,到一定量（够本室使用 3-6 个月的量） ；传染性病毒阳性需经 56、10 小

43、时灭活后使用；过滤，除纤维沉淀物；稀释，用正常人血清或 10%小牛血清 PBS 溶液稀释；测定值，与定值参考品进行对比、求值，一般定在 Cut Off 值附近的阳性值；分装小瓶（每日用量） ，加盖、贴签，-20冻存备用。不使用质控血清的室内质控操作过程的质量控制（分析前、后质控）试剂盒阴阳性对照或标准浓度系列。阴对0.05 阳对-阴对0.8 标准浓度落在 2s 阳对 0.80 ; 范围内病人资料统计，连续观察病人检测结果的资料，并分析该病人其他化验结果的关系。质量保证（Quality Aprovment，QA） 质量保证的核心内容是室间质评。室间质评是一种回顾性评价，主要控制试验结果的准确性，

44、也是某些定量试验量值朔源。评价方法1）发质控物进行调查，这是目前国内外常见的形式，采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将结果报至组织者（部、省临检中心） 。组织者通过统计分析，再将评价结果寄回实验室，使其了解工作质量，发现问题，提高质量。其缺点为由于各实验室吃小灶或互相打电话修改结果而达不到真正评价作用。2）现场调查，事先不通知，临时派出人员到各实验室，规定采用常规方法，检测一组标本，进行评价。这种方法可以解决实际问题，进行现场指导，组织者常因人力、物力的原因而不能经常性进行。成绩计算方法定性试验：检验结果与预期结果一致，得 100 分，错误不得分，总计实验室的得分。

45、从全部参评单位的得分中求出该批质控物平均分（X）和标准差（s） ，再通过公式计算出每一个实验室的得分比值（SI） SI=（实验室得分-平均分 X）/平均标准差（s） SI 在 0.0-0.9 间为良好,1.0-1.9 间为优秀,SI 为负值时数值越大成绩越差。定量试验SI= （实验室测定值-预期值 X）/预期值的标准差 s ; SI 越小，表明越靠近靶值，成绩越好。0-1.0 为优秀,1.1-2.0 为良好,2.0 为差。SI 无正负之分质量改进（Quality Improvement，QI） 质量改进的建议来源于三方面：（1）室内质控：提示实验的精密度差，应规范各项操作；（2）室间质评：提示

46、实验的准确性差，应改进设备的准备或更换试剂；（3）病人或医生的报怨：提示实验的偶然误差，应分析实验的质控过程是否达标。记录所有实验的原始资料均应存档；所有的记录均应规范登记在册；原始登记表应记录试剂来源、批号；质控血清的来源及测定值并注明是否在控；签上实验者姓名及审核者姓名。如试验结果对临床诊断有决定意义，其样本应保留，至少与病历保存期一致。ELISA 原理与分类1. ELISA 的原理ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固

47、相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。2. ELISA 的类型ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即“免疫吸附剂 “（immunosorbent） ；（2）酶标记

48、的抗原或抗体，称为“结合物“（conjugate） ； （3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的 ELISA 主要有以下几种类型：2.2.1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

49、4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg 、HBeAg、AFP 、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成 “夹心复合物“。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect） ，因为标