1、ICS 11.220B 41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/T XXXXXXXXX牡蛎疱疹病毒 型检测技术规范 巢式 PCR法Ostreid herpesvirus-1 Detection Specification- Nested PCRXXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布DB37/ XXXXXXXXXI目 次前 言 II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 术语和缩略语 .13.1 术语和定义 .13.2 缩略语 .14 试剂及仪器 .14.1 试剂 .24.2 仪器 .25 采样 .35.
2、1 采样对象 .35.2 采样数量、方法和保存运输 .35.3 样品的采集 .36 检测 .36.1 DNA 的提取 .36.2 巢式 PCR 操作步骤 .36.3 电泳及测序 .47 结果 .47.1 结果判定 .47.2 结果表述 .4附 录 A （规范性附录） 试剂及配制方法 5附 录 B （资料性附录） 检测目的片段的 DNA 序列及电泳图 7DB37/ XXXXXXXXXII前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山东省渔业标准化技术委员会(鲁
3、TC 03)归口。本标准起草单位：山东农业大学、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生物科技有限公司。本标准起草人：王雪鹏、丁雷、闫现广、王方鹏、郭志明、孙永灿、付天增、姜衡、黄金菁。DB37/ XXXXXXXXX1牡蛎疱疹病毒 型检测技术规范 巢式 PCR 法1 范围本标准规定了牡蛎疱疹病毒型（Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1）的巢式PCR检测方法，适用于对贝类样品进行疱疹病毒型带毒情况的定性检测，以进行牡蛎疱疹病毒 型的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性
4、引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SC/T 7205.1 牡蛎包纳米虫病诊断规程3 术语和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 牡蛎疱疹病毒 型牡蛎疱疹病毒型属于软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae ）、牡蛎疱疹病毒属（Ostreavirus），是一种双链DNA病毒，在世界范围内广泛流行，主要危害牡蛎、扇贝和魁蚶等多种双壳贝类，对贝类养殖业造成重大的损害。3.2 缩略语
5、下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（base pair）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）EB：溴化乙啶（ethidium bromide）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）Taq：水生栖热菌（thermus aquaticus）TE：Tris盐酸和EDTA缓冲液（EDTA TrisHCl）Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris hyd
6、roxymethyl aminomethane）4 试剂及仪器DB37/ XXXXXXXXX24.1 试剂4.1.1 除非另有说明，实验用水均为 GB/T 6682 规定的三级水或相当纯度的水。4.1.2 无水乙醇：分析纯。4.1.3 TE 缓冲液按附录 A.1 的规定。4.1.4 抽提缓冲液按附录 A.2 的规定。4.1.5 蛋白酶 K 按附录 A.3 的规定。4.1.6 10 mol/L 乙酸铵按附录 A.4 的规定。4.1.7 Tirs 饱和酚（pH7.8）：分析纯。4.1.8 4.1.8 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)：分析纯。4.1.9 4.1.9 氯仿/异戊醇(24:1)：分析
7、纯。4.1.10 50TAE：见附录 A.5，也可以直接购买市售产品。4.1.11 1TAE：见附录 A.5。4.1.12 70 %乙醇按附录 A.6 的规定。4.1.13 dNTP（各 2.5 mmol/L）：生化试剂，含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 2.5 mmol/L 的混合物，-20 保存，用于 PCR。4.1.14 10PCR 反应缓冲液：见附录 A.7，也可以直接购买市售产品。4.1.15 MgCl 2 (25 mmol/L)：生化试剂，-20 保存。4.1.16 Taq DNA 聚合酶(5 U/L)：生化试剂，-20 保存。4.1.17 外引物 CF：5-ATTA
8、CCCAGATTCCCCTC-3，-20 保存。4.1.18 外引物 CR：5-CCACAAATGTAAACTGTGAC-3，-20 保存。4.1.19 内引物 C3：5-GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3，-20 保存。4.1.20 内引物 C2：5-TTGCGTTCCGTGACTTCT-3-20 保存。4.1.21 PCR 检测阳性对照：已知受牡蛎疱疹病毒 型感染的贝类组织样品，-80 保存。4.1.22 PCR 检测阴性对照：已知未受牡蛎疱疹病毒 型感染的贝类组织样品，-80 保存。4.1.23 PCR 检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。4.1.24 琼脂糖：分析纯。见附
9、录 A.8。4.1.25 6Loading Buffer：附录 A.9，也可以直接购买市售产品。4.1.26 DNA 分子量标准。4.1.27 溴化乙锭（EB）：分析纯，10 mg/mL，见 A.10，或其他等效产品。4.2 仪器4.2.1 离心机。4.2.2 PCR 仪。4.2.3 电泳仪。4.2.4 水平电泳槽。4.2.5 凝胶成像系统或紫外仪。4.2.6 多功能振荡器。4.2.7 水浴锅或金属浴。4.2.8 -20 普通冰箱。4.2.9 80 超低温冰箱。4.2.10 微波炉电炉或其他加热设备。4.2.11 微量移液器：量程 0.5 L1 000 L。DB37/ XXXXXXXXX35
10、采样5.1 采样对象牡蛎、扇贝和魁蚶等易感双壳贝类。5.2 采样数量、方法和保存运输采样数量、方法和保存运输应符合SC/T 7205.1的要求。5.3 样品的采集稚贝（附着后2 mm）和幼贝（2 mm3 cm）取内脏团；成贝（3 cm）取外套膜和斧足。样品采集后分别置于1.5 mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于-20 。6 检测6.1 DNA 的提取6.1.1 取 30 mg50 mg 组织样品，加入抽提缓冲液 500 L，充分研磨，37 温浴 1 h。提取过程同时设置阳性对照、阴性对照、空白对照。6.1.2 加入 2.5 L 20 mg/mL 蛋白酶 K，至终浓度 100 g/
11、mL，混匀后置于 50 水浴 3 h，不时旋动。6.1.3 将溶液冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合 10 min，于 10 000 r/min 离心 3 min 分离两相。6.1.4 水相移至新 1.5 mL 离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混合 10 min，于10 000 r/min 离心 1 min 分离两相。6.1.5 水相移至一新 1.5 mL 离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混合 10 min，于 10 000 r/min 离心 1 min 分离两相。6.1.6 水相移至一新 1.5 mL 离心管中，加入 100 L 10 mol
12、/L 乙酸铵，混匀后，再加入两倍体积预冷无水乙醇(-20 )混匀，-20 放置 2 h。10 000 r/min 离心 10 min，弃上清。6.1.7 用 70 %乙醇洗涤沉淀 2 次，每次 10 000 r/min 离心 5 min，倾去上清，沉淀于室温晾干。6.1.8 加入 100 L 灭菌双蒸水溶解 DNA。6.1.9 若 DNA 样品需要保存，可溶解于 100 L TE 缓冲液中并保存于-20 。6.1.10 可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化 DNA 抽提试剂盒。6.2 巢式 PCR 操作步骤6.2.1 第一步反应体系及反应扩增程序PCR反应体系如表1所示（25 L反应体系
13、）。阳性样品：牡蛎疱疹病毒 型DNA；阴性样品：健康双壳贝类组织DNA；空白对照：超纯水；检测样品：待检测样品组织DNA。PCR反应条件为：94 预变性5 min；94 变性30 sec、46 退火30 sec、72 延伸1 min，32个循环；72 延伸10 min，4 保温。表 1 25 L 反应体系所加试剂名称 浓度 体积DB37/ XXXXXXXXX4PCR 反应缓冲液 10.0 2.5 L表 1 25 L 反应体系所加试剂（续）名称 浓度 体积dNTPs 2.5 mM 2.0 LCF 25.0M 0.5 LCR 25.0M 0.5 LTaq DNA 聚合酶 5.0 U/L 0.5 L
14、基因组 DNA 100.0 ng/L 1.0 L超纯水 18.0 L合计 25.0 L6.2.2 第二步反应体系及反应扩增程序取6.2.1中PCR扩增产物稀释100倍作为模板，以内引物C3、C2为引物进行PCR扩增，反应体系成分同第一步扩增反应。PCR反应条件为：94 预变性5 min；94 变性30 sec、48 退火30 sec、72 延伸35 sec，32个循环；72 延伸10 min，4 保温。6.3 电泳及测序6.3.1 配制 1.5 %的琼脂糖凝胶，加入 10 mg/mL EB 至终浓度 0.5 g/mL，摇匀。制备琼脂糖凝胶。6.3.2 将 5 L PCR 反应产物与 1 L 6
15、载样缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时设立 DNA 分子量标准对照。6.3.3 在 1 V/cm5 V/cm 的电压下电泳，使 DNA 由负极向正极移动。当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的 1/2 2/3 处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。6.3.4 如果观察到结果阳性，对 PCR 扩增产物进行测序。7 结果7.1 结果判定阳性对照在657 bp处出现条带，阴性对照在657 bp处不出现条带，空白对照不出现任何条带，判断为本批检测结果可靠（如图1所示）。阳性对照未在657 bp处出现条带，或阴性对照在657 bp处出现条带，判断为本批检测失败，需查找原
16、因，重新取样检测。检测样品在657 bp处有条带，测序结果同参考序列（参见附录B）进行比较，若序列符合可判断待测样品为牡蛎疱疹病毒型PCR阳性；当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，报告结果为阴性。7.2 结果表述阳性结果报告为该贝类样本中存在牡蛎疱疹病毒型DNA。阴性结果报告为该贝类样本中不存在牡蛎疱疹病毒型DNA。DB37/ XXXXXXXXX5A A附 录 A（规范性附录）试剂及配制方法A.1 TE缓冲液(pH8.0)1 mol/L TrisHCl(pH8.0) 10 mL0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 2 mL加水定容至 1 000 mL高压蒸气灭菌，
17、4 贮存。A.2 抽提缓冲液1 mol/L TrisHCl(pH8.0) 1 mL0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 20 mL1 mg/mL 胰RNA酶 2 mL10 % SDS 5 mL加水定容至 100 mL混匀，室温贮存。A.3 20 mg/mL 蛋白酶K蛋白酶K 20 mg水 1 mL溶解后分装于无菌离心管中(0.25 mL/管)，20 下保存。A.4 10 mol/L 乙酸铵乙酸铵 77 g水 30 mL加水定容至100 mL，经0.45 m滤膜过滤除菌。4 贮存。A.5 50和 1 TAE缓冲液50 配制方法：称取 242 g Tris碱、37.2 g Na2EDTA2H
18、2O 于锥形瓶中，然后加入800 ml去离子水充分搅拌溶解，再加入57.1 mL冰醋酸，充分混匀后定容至1 L，室温保存。1 TAE缓冲液：取100 mL 50TAE缓冲液，加900 mL去离子水混匀，室温保存。A.6 70 %乙醇DB37/ XXXXXXXXX6无水乙醇 70 mL加水30 mL，混匀，定容至 100 mL分装后，室温贮存。A.7 10PCR反应缓冲液10PCR反应缓冲液配制方法：称取Tris-HCl 31.52 mg，置于15 ml塑料离心管中，向离心管中6 ml去离子水，充分搅拌溶解。加入KCl 74.55 mg，加入MgCl2 2.86 mg，充分搅拌溶解，最终用去离子
19、水定容至10 ml，-20 冰箱保存备用。A.8 琼脂糖凝胶在电泳区用1TAE电泳缓冲液配制1.2 %的琼脂糖凝胶，建议于三角烧瓶中配制，在电炉上或微波炉中加热至溶液完全透明(为避免煮沸时液体外溢，胶液体积应少于容器体积的1/4)。待溶液冷却至60 左右，加入10 mg/mL溴化乙锭(EB)(有毒)至终浓度0.5 g/mL，摇匀。将凝胶液缓缓倒入设置好样孔梳和防漏条/套的水平放置的凝胶船，胶液厚度0.6 cm0.8 cm。样孔梳底部水平深入凝胶层约0.3 cm0.5 cm，并距凝胶底部0.2 cm，以免穿透。待凝胶完全凝固后，小心拔掉样孔梳，去掉防漏条/套，即可用于电泳。A.9 6Loadin
20、g Buffer6Loading Buffer配制方法：称取溴酚兰25 mg、二甲苯腈蓝FF 25 mg，置于15 ml塑料离心管中，向离心管中6 ml去离子水，充分搅拌溶解。加入3 ml甘油混匀，最终用去离子水定容至10 ml，室温保存。A.10 10 mg/mL 溴化乙锭(EB)贮存液溴化乙锭(EB) 10 mg水 1 mL磁力搅拌数小时以确保其完全溶解。室温保存于棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中。DB37/ XXXXXXXXX7B B附 录 B（资料性附录）检测目的片段的 DNA 序列及电泳图B.1 扩增目的片段的DNA序列Attacccagattcccctcgaggtagcttttgtcaag
21、atgaaacaaaatattatgcaacgaggaaattatacgtcaacatacaacatcactgtgaatacaacggagatttgacaaggtgttctataccatacgacctacacaaacctgtttttgaaaacaggtgtgaagagaaaccaaatgtgtgttatcccaatgcactctttaccatgaagatacccaccaatgtggtaaagacggaacaatctttttctaggatatggagctgcggcgctatggatttaacgagtgccaccaaaagttgggataatgattttagaatagatgtgatgtgcggca
22、agatgaatggcaagatacacaatgagctattacccgaccacaaacctaacgttgtattcgattacggattaagaaaatgggttccacaatctaaaattaaaaacccacatgggggccaaggaatttaaagccccggggaaaaaagtataaataggcgcgatttgtcagtttagaatcatacccacactcaatctcgagtataccacaactgctaaattaacagcatctactactactactgaaaaatgcagcctttcacagaattttgcaccttgaccaaagccatcacatcagccagca
23、acgactttttcatcaaccagacgaggttaacatgcgacatttgtaaagagctcgtctctttcaattgcaaagataaagtcgtggcatcattggctgcagtcagatctgacatacccatagaagtcacggaacgcaaagacctgaacctcctcgacctgatccagttcttcgaaaagaagatagagtttaccactctcattgacgaattgttcactgcccacaaagaccattgtcagaaaaatggtaagccgtgcaccatgctcagcatcattgccggtagatacaccaatgaactttacc
24、gcgaagagtccatagaggagaatagatcatgggtgctga aggcatacaaattggacctgatcaatcaacagttctttaggaataacaggttatacgacatcctgaaagaggccggtgtagagaatttggagaggatcatgttagaagatgaaattgaatctgtttgcaagaccaaggccaaatctcccgaagaggtgattaccaagatgattccggaacaattgaccaagctattggaactgatgtcgtgcccccagaaacaggtcacagtttacatttgtggB.2 示例以虾夷扇贝为检测对象，以感染的虾夷扇贝为阳性对照，以未感染的虾夷扇贝为阴性对照，以灭菌双蒸水为空白对照。结果如图1所示。注：其中“-”为阴性对照，“+”为阳性对照，“M”为DL2000 DNA Marker，1-8为样品编号，C为空白对照。图 B.1 检测样本 PCR 电泳图_
