1、近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。特贡献了 western 显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照 pierce 公司的说明书。限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。Western 荧光检测取决于抗原含量一抗敏感度二抗敏感度 底物敏感度显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压 1030s，看不到则同时压两张，1030min 洗一张，如果无则再补一张,1h 后洗。再无，则压过夜。共 3 张片，根据每次结果调整。其中两张片子的压法如
2、下描述: 先剪一张比膜长 23 厘米的片子（以供贴胶带） ，然后剪 2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上） ，然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。 在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶
3、片感光稍微比上面一张强一些。现象- - - - - - - - - - - - - - - - - - -原因 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -解决反影(白色条带,黑色背景) - - -1 HRP 过高(背景较高) - - - - - - - - - - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可 410 倍)*注 1显影后膜上条带处变为黄色- - -2 HRP 过高(敏感性太高)- - - - - - - - - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可 410 倍)*注 2信号弱或无- - - - - - - - - - - 3 HRP 过高引起底物迅
4、速耗竭- - - - - - - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可 410 倍)*注 3- - - - - - - - - - - - - - - - - - -4 抗体-抗原系统敏感性过低- - - - - - - - 提高抗体浓度/ 蛋白上样量*注 4- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -5 转膜不充分/ 过转- - - - - - - - - - - -优化转膜条件*注 5- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -6 HRP 或底物活性降低- - - - - - - - -测试活性或选用敏感底物 *注 6高背景-
5、 - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP 过高(背景较高) - - - - - - - - - - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可 410 倍)*注 7- - - - - - - - - - - - - - - - - -8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - - - - - - 延长封闭时间 4 度过夜最好*注 8- - - - - - - - - - - - - - - - - - -9 抗体与封闭液有交叉- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA 的 TBST)*注 9- - - - - - - - - - -
6、 - - - - - - - - -10 TBST 洗脱不足 - - - - - - - - - - - - -增加洗脱时间、次数、用量*注 10- - - - - - - - - - - - - - - - - - -11 暴光时间过长 - - - - - - - - - - -降低暴光时间*注 11- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -12 抗原-抗体浓度过高 - - - - - - - - - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注 12条带内无显影的白点-13 转膜不良（如有气泡在胶 -膜之间) - - 精细操作*注13- - - - - - -
7、- - - - - - - - - - - -14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/ 戴手套用平头镊子持膜*注 14- - - - - - - - - - - - - 15 膜与 X 光片间有气泡- - - - - - - - - - - -显影前去除气泡*注 15非特异性条带- - - - - - - - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - - - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可 410 倍)*注 16- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -17 SDS 非特异性结合蛋白条带
8、- - - - -使用无 SDS 转膜液*注 17散在小圆斑 - - - - - - - - - - - -18 封闭液有杂质颗粒- - - - - 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注 18*注 1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处 HRP 很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景 HRP 较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因 3 的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问
9、题。也可以过一段时间鼿 RP 稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因 3 的现象。其分析和解决同上。*注 2 其原因主要是 HRP 太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因 1 或原因 3 的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物 12min 就可以看出来，所以要把握时机） 。如果没有达到原因 1 和原因 3
10、的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因 1 和原因 3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压 10s30s，甚至可以 35s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于 HRP 过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。但对于小分子蛋白（6h）二抗实际使用稀释度：1：800 ；洗膜时间次数：洗三次，均为 10 分钟
