1、CMA、FISH及SKY,FISH、SKY和 CMA简介 基因芯片(CMA)临床应用,目 录,技术简介,FISH、SKY和CMA技术的应用与原理,人类染色体基本知识,技术简介,是人类重要的遗传物质之一。 是基因的载体：人类所有基因在染色体上呈线形成对排列，顺序和毗邻关系恒定。 可被碱性染料着色,呈现不同的条带。 每个正常的有核细胞均含23对染色体称为2倍体，其中一对为性染色体，决定性别，男性46,XY，女性46,XX。,技术简介,未经过G显带技术处理的染色体核型,G显带正常男性核型,技术简介,1879年，W. Flemming提出了染色质（chromatin）这一术语，用以描述细胞核中能被碱性
2、染料强烈着色的物质。 1888年，德国解剖学家沃德耶 ( Waldeyer）正式提出染色体的命名。,技术简介,经过一个多世纪的研究，人们认识到，染色质和染色体是在细胞周期不同阶段可以相互转变的形态结构 。,染色质是间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA组成的线性复核结构，是间期细胞遗传物质存在形式。 染色体是细胞分裂中期，由染色质高度聚缩而形成的棒状结构。,技术简介,1923年以前，生物诸多生物科学家为搞清楚人类染色体的数目，采用各种技术进行了辨认和分析，认为人类染色体为48条。,1956年以前，美籍华人蒋有兴12月22日在瑞典隆德大学莱文的实验室发现人类二倍体细胞的染色体数目为4
3、6条1956年1月26日遗传杂志上发表，从而开创了人类细胞遗传学的历史。,技术简介,未经过G显带技术处理的染色体核型,G显带技术染色体核型,1970年,1p13,分析方法,技术简介,技术简介,G显带技术方法和缺点,1、培养时间长，需要72小时或更长 2、对样本要求高，无污染、新鲜、细胞活力高 3、对培养基要求高，模拟体内营养、有效期内使用 4、分析难度大，需要有丰富的经验。 5、一般情况下，培养失败率约为5%,能否省去 培养过程？,技术简介,荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）,1986年Cremer 与Licher 等利用异硫氰酸盐荧
4、光素作为染色体某特定片段的DNA探针，杂交后在荧光显微镜下观察分析。,技术简介,技术简介,断裂点定位,技术简介,FISH技术方法和缺点,FISH技术敏感、特异、易于观察，但探针类型有限，适合于针对 性分析，临床一般分析发生异常频率最高的几条染色体（211318XY等） 或用于结构畸变的区域鉴别与验证。,如果能在FISH的基础上建立一种方法,该方法将FISH的敏感性和特 异性与一次分析所有染色体相结合,染色体核型分析将得到完整、精确 的分析，光谱核型分析(spectral karyotype, SKY)技术就达到了这样的 目的。,技术简介,光谱核型分析(spectral karyotype, S
5、KY),Suchrock 等于1996年建立了光谱 核型分析技术（SKY）。用5种不同的荧光素或其组合做 不同的标记,显示24种颜色，代表24 种染色体体。用一特制光源和一特制 滤镜可使所有染料被激发并能同时测 量它们的发射光谱。杂交结果可以用 显示色和分类色呈现在计算机屏幕上,技术简介,技术简介,SKY常用于： 肿瘤遗传学特别是血液系统肿瘤的检测 医学遗传学染色体数目和结构畸变分析，标记染色体的识别,技术简介,SKY技术的缺点：能检测染色体微小重复和缺失,基因芯片可以解决这个问题,基本状况,1998 年底 美国科学促进会将基因芯片技术列为 1998 年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学
6、史上的意义。目前已应用于生物科学众多的领域之中。,在实际应用方面：疾病诊断和治疗、 药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。它将为人类认识生命的起源、 遗传、发育与进化、为疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为 生物大分子的全新设计和药物开发中 先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。,基因芯片(Chromosomal Microarray Analysis ，CMA),目前基因芯片类型主要区别是探针的载体和探针的设计,基因芯片基本原理,Affymetrix:270万个探针（195万oligo，75万SNP），ISCA和癌症相关基因
7、覆盖率均为100%，以及2817种OMIM疾病基因。可检出5mb的LOH，100kb的CNV。 Agilent: 180万个探针（120万oligo，60万SNP），ISCA基因覆盖率100%，癌基因覆盖率73%，可检出510mb的LOH，400kb的CNV 。,基因芯片基本原理,.以微球为载体的基因芯片技术,采用3um微珠，与单核苷酸相连（23bp地址序列和50bp探针构成） 地址序列编码每种微珠，用于解码 每种微珠与探针单独反应，混合在一起成为“微珠池“ 不同微珠代表不同检测信息，例如基因或 SNP位点等 在“微珠池“中插入若干光纤，每个 光纤末端连接一个化学蚀刻微孔，每个微孔只能容纳一个
8、微珠 微珠无序组装，每个光纤代表一个微珠,基因芯片基本原理,.原位合成法（光刻技术）,在合成碱基单体5羟基末端连接一个光敏保护基 首先使支持物羟基化，并采用光敏保护起来 每次选取适当蔽光膜使需要聚合的部位透光，受光部位脱羟基保护而活化 每次通过控制蔽光膜的图案（透光或不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序，就可以实现在待定位点合成预定序列,细胞遗传学及染色体核型分析发展历程,技术简介,技术简介,三种技术检测染色体的对比,FISH、SKY和 CMA简介 基因芯片(CMA)临床应用,目 录,基本状况,最大的优点是高通量，其次是解决了目前遗传物质盲区的检测（基因组病），是细胞遗传
9、向分子遗传过度的技术，检测精确度高，可以发现未知片段。,基因芯片的优点,基因芯片基本原理,.SNP array：以检测SNP位点为主的微整列基因芯片技术即单核苷酸多态性微整列Single nucleotide polymorphism array .aCGH： 以检测CNV位点为主的微阵列基因芯片技术即拷贝数变异微阵列Copy number variation array,临床上最常用基因芯片技术,aCGH是基于微阵列的比较基因组杂交技术：基因芯片和比较基因杂交技术结合array-based Comparative Genomic Hybridization,基因芯片基本原理,aCGH技术检测
10、原理,参照基因组标记绿色，待检基因组标记红色 混合后进行杂交，判断如下：若参照基因组和待检基因组相同，即显示黄色若某位点缺失，及显示绿色若某位点增多，即显示红色,基因芯片临床应用,实例：先证者为一例新生儿，其父母双亲表型和智力未见异常,基因芯片基本原理,Array-CGH图谱中， 发现两处CNVs异常：1p36.33和1q21.3,Array-CGH 分析,基因芯片基本原理,CMV临床应用,提高检出几率 临床指导规范 临床应用指证 科学研究方向,提高检出几率,基因芯片临床应用,引用：东莞市妇幼保健院产前诊断中心,提示： 常规染色体核型分析正常的产前样本中，采用aCGH技术检出15例异常，异常率
11、约为6.5%,基因芯片临床应用,基因芯片临床应用,基因芯片临床应用,引用：医学遗传学国家重点实验室病例材料,基因芯片临床应用,先证者,儿子,Chr12.17688908bp-17940493bp,28724178bp-28889151bp,28724178bp17688908bp=11Mb 重复,儿子,提示： 采用 SNP Mapping 100K Array 全基因组拷贝数检测，查明12号染色体短臂重复11Mb,染色体新发相互易位产前诊断,孕妇为46,XX,t(1;17)，一次不良妊娠史，胎儿存在t(1;17)和t(3;18)，夫妻希望生育此胎儿，经SNP array检测发现了13处拷贝数改
12、变，经查阅数据库，不支持致病，后生育一健康小孩。,2012年2月复诊照片,基因芯片临床应用,临床指导规范,基因芯片临床应用,美国遗传协会 ACOG 2009,基因芯片临床应用,加拿大遗传协会 CCMG 2010,基因芯片临床应用,基因芯片临床应用,应用指证,基因芯片临床应用,.aCGH在原发性智力低下原因分析中的临床应用,基因芯片临床应用,续表,基因芯片临床应用,.aCGH在产前诊断中的应用,基因芯片临床应用,应用aCGH进行临床检测的注意事项,CMA国际应用指南总结（1）,CMA产前诊断临床适应症 产前超声或磁共振（MRI）检查提示胎儿结构异常：推荐CMA技术替代染色体核型分析作为一线检测方
13、法 胎儿核型为遗传自亲代或为新发平衡重组且表型异常：推荐CMA进一步检测 胎儿核型无法明确诊断的染色体：推荐CMA技术进一步检测。这种情况包括衍生染色体、标记染色体等，通过CMA检测可帮助明确异常片段的来源和性质 无明确超声结构异常但接受产前诊断的胎儿样本：CMA和核型分析可任选其一这种情况包括孕妇高龄、血清学筛查阳性、孕妇焦虑、不良生育史、染色体异常家族史、超声软指标阳性等 胎死宫内及死产：推荐CMA技术检测（如羊水、胎盘和流产物）以提高检出率,基因芯片临床应用,CMA国际应用指南总结（2）,检测前咨询及知情同意检测前，应该由经专业培训及具相应资质的临床遗传医师对孕妇及家属做检测前遗传咨询，
14、充分告知CMA检测的优势、局限性和可能的结果等，并签署知情同意，对产前CMA检测非常必要 优势：能检出所有引起基因组不平衡改变的染色体异常，包括所有核型分析可检出的变异和无法检出的微缺/重复 局限性： 无法检测平衡染色体重组（漏诊率0.6%）、10%嵌合体 、某些标记染色体、单基因突变及DNA甲基化。若使用的是aCGH芯片还无法检测三倍体 可检出不明确CNV（VOUS）：这时需对父母做检测，通过家系分析，以协助对胎儿检测判读。但多数情况下，基于目前对人类基因组的认识和数据库的积累程度，仍然无法对某些检测结果进行精确判读和解释,基因芯片临床应用,检出疾病的遗传异质性：所检出的某些遗传性疾病由于外
15、显率和表现度的差异，在不同患者间临床表现可能存在很大的变异。 可能检出与临床表型不相关的CNVs：通过CMA检测可能发现非亲生父亲、近亲婚配、迟发性的遗传病或成人期发病的遗传病（如肿瘤），这些结果应该让孕妇及家属选择是否被告知。,临床报告至少应包括以下几方面内容： 内容及局限性：所使用CMA技术平台的检测内容和局限性。 芯片类型：包括芯片的名称、探针数目、分辨率等。 CNVs的位置、变异类型及片段大小：细胞遗传学位置（染色体数目和细胞遗传学区带定位）、线性坐标（起始及终止位置），CNV拷贝数及变异类型（如染色体缺失、重复、杂合性缺失），CNV片段的大小。,CMA国际应用指南总结（3）,基因芯片
16、临床应用,CNVs的性质：阐明每个CNV性质（致病性、非致病性即多态和 不明确临床意义CNV又分可能良性、可能致病和不明确），并提供证据和参考文献。 结果解释：在临床实践中，常规的作法是参考国际公共数据库（DGV、ISCA、DECIPHER、OMIM等）、同行比对数据库、实验室内部数据库及检索最新文献信息（Pubmed）对所检出的CNVs进行注释。对于有明确临床意义CNVs，可直接报告对应的遗传综合征或临床上最相关的致病基因。对于不明确意义CNVs，建议检测父母是否为携带者是排除家族性良性CNVs的最好办法。,基因芯片临床应用,检测后咨询及临床处理 检出非致病性CNVs胎儿CMA检测结果阴性提
17、示基本可以排除由基因组不平衡改变而导致的遗传病，但必须向患者说明CMA不能检测所有的遗传病，如极低比例嵌合体（10%）、平衡染色体重组、单基因突变等,CMA国际应用指南总结（4）, 检出致病性CNVs 胎儿检出明确致病性染色体微缺失或微重复综合征：若其父母有再次妊娠计划，应建议父母行CMA检测以明确胎儿致病性片段是新发突变还是遗传自父母，以对再次生育作遗传风险评估胎儿同时检出缺失和重复：胎儿的缺失/重复可能来源于亲代的染色体平衡易位片段的不平衡分离，若其父母有再次妊娠计划，应对父母样本进行FISH或染色体核型分析以排除染色体相互易位或倒位，并对再发风险进行评估,基因芯片临床应用, 检出不明确C
18、NVs（VOUS）应建议父母行CMA检测，通过家系分析以协助对胎儿检测结果的判断新发的CNVs若有证据表明该区域内有疾病表型相关功能基因，通常认为可能致病否则，通常认为是可能良性由于基因组的许多区域都存在一定的突变率，确实有些CNV可能是新发突变，但还未发现其临床意义。若只有单亲样本行CMA检测，且在该单亲样本中未发现类似CNV，则对该CNV无法做出临床意义的推断,遗传性CNVs若胎儿父母有临床表型，同时该区域内有疾病表型相关功能基因，通 常认为该CNV为可能致病性若胎儿父母无临床表型，通常认为该CNV为家族性良性CNV若胎儿CNV与亲代CNV大小不同，且缺失或重复的范围扩大了，则应考虑为可能
19、致病。此外，在某些情况下（如多个家系有类似文献报道），还需考虑不完全外显、临床表型差异（父母可能有亚临床表现）的可能情况,基因芯片临床应用,基因芯片临床应用,科学研究领域,基因芯片临床应用,.产前诊断回顾性研究,基因芯片临床应用,胎儿中枢神经系统异常检测中的研究,基因芯片临床应用,aCGH分析结果,东莞市产前诊断中心成立于2011年3月，目前36人博士学位1人，硕士12人，正高级6人，副高级6人 国家卫计委批准的首批产前高通量测序试点单位 东莞市胎儿21-三体综合征无创产前检测定点单位 耳聋基因筛查和高危孕妇产前诊断的定点单位 东莞市地中海贫血防控的技术指导单位和培训单位 东莞市出生缺陷防控指导和培训单位,东莞市产前诊断中心简介,承担各类各级科研课题10余项，总资助金额近200万元,续,近5年发表论文20余篇，其中SCI收录12篇,续,
