1、枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶液体发酵培养基优化及条件的研究摘要：通过单因素实验在摇瓶条件下对枯草芽胞杆菌产碱性蛋白酶的液体培养基进行优化，确定了最佳碳源为糊精。进一步在 5L 的发酵罐上进行发酵并对发酵过程进行控制得到以下结论：枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶为生长相关型发酵类型，生长周期为 38h，发酵到 36h 时酶活达到最大 ，酶活最大值为433U/mL，此时 pH 为 8.35，OD600 为 1.158。可以用 pH 是否超过 8 来当作发酵终点的表观特征。关键词：枯草芽孢杆菌 液体发酵 培养基优化 发酵条件引言：碱性蛋白酶(Alkaline protease) 广泛存在于微生物中,最早发现在猪
2、的胰脏中1 ，1913 年 Rhom 首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945 年瑞士的Dr. J agg 等发现了微生物碱性蛋白酶，使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途，如添加到动物饲料中以提高饲料利用率；用于制作海鲜调味品；用于 CGM(玉米渣) 的水解，以制取玉米肽饮料；水解大豆蛋白生产大豆多肽等。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株，具有产蛋白酶量大，耐高温、高碱等特点，因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点5。我国研究和
3、生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高，但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂，并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口6。本实验通过对枯草芽孢杆菌发酵培养基进行优化，并对发酵过程进行研究，以期进一步提高枯草芽孢杆菌产粗酶的活力及确定其最佳产粗酶的时间段。1 材料与设备仪器1.1 菌株枯草芽孢杆菌(由实验室提供)1.2 材料与试剂福林试剂、三氯乙酸（0.4mol/ L） 、碳酸钠溶液 （0.4mol/L） 、干酪素溶液(10g/L)氢氧化钠溶液（0.5mol/L） 、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、无水氯化钙。1.3 仪器与设备恒温水浴锅、分光光度计、5 升发酵
4、罐、离心机、试管、吸管、滤纸、酸度计、高压灭菌锅、超净工作台 、恒温摇床1.4 培养基基本培养基：胰蛋白胨 5g/L、柠檬酸钠 3 g/L、磷酸氢二钾 10 g/L、氯化钙3 g/L种子培养基：胰蛋白胨 5g/L、酵母粉 5 g/L、葡萄糖 10 g/L、磷酸氢二钾18 g/L发酵培养基：酵母粉 2g/L、胰蛋白胨 3 g/L、糊精 50 g/L、柠檬酸钠3g/L、 、磷酸氢二钾 10 g/L、氯化钙 3 g/L配培养基时水用自来水。2 方法 2.1 酶活测定2.11 标准曲线制备表 1 不同酪氨酸浓度下的吸光值 A680管号酪氨酸浓度（ug/L ）酪氨酸使用/ml水/ml 0.4mol/L
5、Na2CO3吸光值/A 6800 0 0.0 1.0 5 01 10 0.1 0.9 5 0.1112 20 0.2 0.8 5 1.20653 30 0.3 0.7 5 0.3244 40 0.4 0.6 5 0.41655 50 0.5 0.5 5 0.52根据表 1，以酪氨酸浓度为纵坐标，吸光值 A680 横坐标，绘制标准曲线。由绘制出的曲线进行线性回归得线性方程。令 x=1 算出 y 值，即得到吸光常数K 的值。2.1.2 酶活测定公式计算酶活公式如下：样品的酶活力(U/ml)（A680*n*k*4）/10式中：A 为样品平行实验的平均吸光度； K 为吸光常数取 96.54；4 为反应
6、试剂的总体积(ml)；10 为反应时间(min )；n 为稀释倍数。酶活力单位定义为：在温度 55 pH10.0 条件下，1min 水解酪素产生1g 酪氨酸所需酶量定义为 1 个酶活力单位，以 U 表示。2.2 摇瓶条件确定最佳碳源2.2.1 配制碳源分别为不同唯一碳源的培养基，在 150mL 的三角瓶中装25mL 并在 121下高压灭菌 20min。2.2.2 以接种量为 4%进行无菌接种2.2.3 在摇床中 37下培养 48h，转速为 160r/min,pH 为自然。2.2.4 把样品稀释成 10 倍和 50 倍，在 12000r/min 离心 15min，取上清液测定酶活。2.2.5 以
7、酶活为指示确定最佳碳源2.3 发酵罐过程控制160 r/min， 37恒温振荡培养 12 h 制备种子液，采用 5 L 发酵罐，接种量为 2.5%。发酵罐中的装液量为 60%，进行恒溶氧变温发酵。并在发酵开始12h 时开始过程控制，每隔 2 h 取样，并记录温度、转速、溶氧，发酵液在 2 000 r/min，离心 15 min，取上清测定发酵液的 OD600、pH 值、A 680 并采用福林法测定蛋白酶活力 1。3 结果与分析3.1 碱性蛋白酶活力测定的标准曲线制备以酪氨酸浓度为纵坐标，吸光值 A680 横坐标，绘制标准曲线如图 1。图 1酪 氨 酸 浓 度 与 吸 光 值 /A680的 标
8、准 曲 线y = 96.241x - 0.3113R2 = 0.9993-1001020304050600 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6吸 光 值 /A680酪氨酸浓度（ug/mL）由绘制出的曲线进行线性回归得线性方程 y=96.241x-0.3114，R 2=0.9993，算的 K=95.9297。可看出 R2 值比较接近于 1，标准曲线可以用，不过酪氨酸浓度必须在 050ug/mL 范围内才能此 K 值计算酶活力。3.2 不同碳源对芽孢杆菌产碱性蛋白酶的影响分别选用蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉制备不同碳源为唯一碳源，在基本培养基及其他条件不变的情况下，以酶活为指示
9、确定最佳碳源为糊精。图 1不 同 碳 源 培 养 基 中 碱 性 蛋 白 酶 的 活 力050010001500200025003000350040004500糊 精 乳 糖 蔗 糖 可 溶 性 淀 粉 葡 萄 糖碳 源 种 类酶活力（U/mL）酶 活可能是因为糊精是由支链淀粉部分水解而得。它既是持效碳源，又含有部分分子量较小、结构简单、容易被菌体利用的碳源，这样既有利于菌体在生长前期大量的繁殖生长来更快的渡过延滞期而达到稳定期，也可以延长菌体的稳定期而增加菌体合成碱性蛋白酶的时间。3.3 发酵罐过程控制在摇瓶条件优化的基础上进行了 5L 发酵罐的发酵培养，并对发酵过程进行了控制，过程中测定了
10、发酵温度、OD 600、DO、pH 、酶活。发酵结果如图 2和图 3。10152025303540272829303132334 温 度OD60 酶 活时 间 (h)温度 () 0.0.20.40.60.81.01.2OD0102030405060DO01020304050酶活图 2 芽孢杆菌在 5L 发酵罐中发酵的特性曲线图以发酵时间为横坐标，发酵温度、DO、OD 600、酶活为纵坐标做曲线图。从图 2 可看出：发酵过程延滞期较长。发酵初期发酵罐中营养物浓度较高，使菌体处在高渗环境中，影响了菌体对营养物的吸收利用且接入的菌需要适应新环境导致延滞期较长 。发酵过程总述：017h 为延滞期，菌体
11、基本不进行生长繁殖，但细胞内合成酶的系统开始启动，胞内产生大量用于分解和利用营养物的酶，包括碱性蛋白酶，为菌体下一步大量繁殖做准备。此时发酵液中碱性蛋白酶的含量有一个较小的上升趋势。OD600 即具体浓度基本不变，菌体的需氧量也少，所以 DO 也呈水平趋势且在较高水平。1728h 为对数生长期，菌体适应环境之后开始利用发酵罐中丰富的营养进行大量的繁殖，但由于发酵液体积较多，相对来说菌体浓度（OD 600）增长幅度不是太大。此时已有一定数量菌体，且菌体呼吸强度很大，总的耗氧量比较大而且发酵液黏性较大又产生很多泡沫导致供氧上不去，所以溶氧有一个突然下降趋势。大量菌体产生的同时产酶量也有很大的增加，
12、酶活达到最大的同时OD600 也达到最大，从这里可以看出碱性蛋白酶的产合成与细胞生长密切相关，所以属于生长相关型。在 26h 进行了升温 ，由 32升到 34时，对应的酶活有所下降，说明温度突然的变化会对菌体的生长有所影响。可以考虑进行逐级升温操作，避免环境突然的变化使菌体又不适应了。2336h 为稳定期，当菌体快速繁殖，菌体达到一定数量不在增加，此时培养基物质的消耗大部分用于蛋白酶的合成，需氧量相对于对数生长期小，但还是大于发酵罐的供氧系统，所以 DO 有一个较缓的下降趋势。 酶活急剧增加，到 36h 时酶活达到最大为 433U/mL 。OD 600 同时也达到最大。3640h 为衰亡期，由
13、于营养物质基本耗尽，有害代谢产物大量积累，使菌体衰老并自溶，OD 600 急剧下降，酶活开始下降。此时就可以倒罐了。判断最佳倒罐时间为 3537h。1015202530354001020304050 酶 活转 速 DOpH时 间 (h)酶活(U/mL) 101502025030350转速 (r)0102030405060DO6.57.07.58.08.5pH图 3 芽孢杆菌在 5L 发酵罐中的发酵特性曲线图由图 3 可看出，初始 pH 为 6.89，随着菌体缓慢开始分解碳源产生少量CO2 和酸性中间代谢产物，pH 稍微降低。但由于发酵故障使发酵罐的供氧为0，当菌体把发酵液中存在的氧消耗完之后代
14、谢产生异常，使 pH 在 16h 之后突然上升，属不正常现象。当溶氧恢复后，菌体在 20h 恢复正常生长，pH 开始下降。对数期到 28h 结束，菌体不再大量繁殖，吸收的营养物质主要用于碱性蛋白酶的合成，呼吸强度变 低，不会产生大量的 CO2，产生的酸性中间代谢产物也变少，所以 pH 开始急剧上升。4 结论枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株，具有产蛋白酶量大，耐高温、高碱等特点。采用枯草芽孢杆菌为发酵菌种，在摇瓶中用单因素实验确定最佳碳源为糊精。进一步在 5L 发酵罐上进行过程控制研究发现：枯草芽胞杆菌发酵产碱性蛋白酶是生长相关型发酵。生长周期为 38h，发酵到 36h 时酶活达到最大 ，
15、酶活最大值为 433U/mL，此时 pH 为 8.35， OD600 为 1.158。最佳倒罐时间为 3638h，可以把 pH 超过 8 当作判断发酵终点的标准。 5 参考文献1 杨冠东, 杜少平, 杨础华, 黄琼. 产碱性蛋白酶的嗜热菌株筛选及发酵条件研究J. 食品与发酵工业 , 2008,(10)2 姚刚, 程建军, 孙鹏, 李倪薇. 枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的研究J. 食品科学 , 2009,(23)3 杨金龙 , 潘康成, 赵小林. 高产碱性蛋白酶地衣芽孢杆菌的研究进展J. 河南农业科学 , 2005,(01)4 苑琳, 戚薇, 路福平, 杜连祥. 嗜碱性芽孢杆菌产高碱碱性蛋白酶发酵培养基及发酵条件的研究J. 食品与发酵工业 , 2004,(06)5 张丽霞, 李荣禧, 王琦, 梅汝鸿. 枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化J. 中国生物防治 , 2006,(S1)6 徐威 , 苏昕, 李福德. 碱性蛋白酶产生菌的筛选及发酵条件考查J. 生物技术 , 1997,(03)7 李佳, 刘克武 . 微生物碱性蛋白酶研究进展J. 四川食品与发酵 , 2004,(01)
