1、 种苗带病检验技术 种苗带病是植物病害初次侵染的主要来源，也是病害远距离传播的重要途径，因此，种苗带病检验在研究病害发生规律和确定防治措施以及实施植物检疫等方面都是非常重要的。种苗带病检验的方法。应根据检验对象本身的特点和带病的性质加以选择。本次实验通过肉眼检验，培养检验和洗涤检验等进一步了解种苗带病检验的基本原理和学习常用的检验方法。一、实验内容、材料和方法(一)肉眼检验用肉眼或借助放大镜直接观察大豆和小麦种子带病的情况。现为实验所提供的材料为“平均样品”，用“正方形四分法”分样得到不少于 200 粒的“试验样品”后，调查带病率，大豆种子要求调查褐斑粒、紫斑粒、霜霉以及所夹杂的菟丝子种子，小
2、麦种子要求调查黑胚粒、赤霉粒、麦角以及腥黑穗病的菌瘿和线虫病的虫瘿。(二)培养检验对潜伏在植物组织内部的病原菌及需要较多的菌量才能鉴定的样本，则采用培养检查法，培养检验又分保湿培养和培养基培养两种方法，病原菌分离实验(实验三)中的小麦根腐菌的分离，实验上就是利用培养基培养法进行的，因此本次实验又做保湿培养检验。实验材料：怀疑带病的稻种。实验方法：用培养皿内衬滤纸并注入适量的无菌水制成保湿室，然后将怀疑带病的稻种用清水洗净，再以清洁的镊子移置于保湿器内，种间保持一定距离，每皿摆 20 粒，之后将其放在25左右的恒温箱中，保湿培养 2448 小时，待种子上表现症状后，即可用显微镜检查鉴定，注意是否
3、带有稻瘟病和恶苗病等。(三)洗涤检验洗涤检验是种子带病检验的最常用的方法，按其处理手段不同又将此法分为离心沉淀和滤纸过滤两种，本次实验仅实践离心沉淀法。实验材料和目的：检验小麦种子携腥黑穗病菌的数量。二、 实验步骤和方法：1.洗种：在用“正方形四分法”分样所得的“试验样品”中取麦种两份，每份 100 粒，分别放在两个 50 毫升的三角瓶中，各加入 10 毫升的蒸馏水，剧烈振荡 510 分钟，洗下种子的表面粘附的黑粉孢子，再将洗涤液倾入离心管中，其中 1 份为重复，如果两份所得结果相差悬殊，则需重作。2.离心沉淀，在离心机中，以每分钟 10001500 转的速度离心 5 分钟，使孢子完全沉淀于离
4、心管底部。3.制备孢子悬浮液，离心后倒去离心管上部不含孢子的澄清液，留下底部 1 毫升，如果没有带刻度的离心管时，也可将上清液倒去后，轻轻地用吸水纸条吸净多余的水，另用吸管加入1 毫升的蒸馏水，摇动离心管，使孢子重新悬浮于水中，制成均一的孢子悬浮液。4.测所用吸管 1 毫升蒸馏水的滴数(A)，连续测 3 次，求平均滴数，操作时注意持吸管的方向务须垂直水平面，否则所测滴数不准。5.求盖玻片所含视野数(D)(1)求盖玻片面积(B) B=长宽(2)求所用物镜和目镜下视野的面积(C) C=R 2R 为视野半径，用镜台测微尺量测(3)求盖玻片所含视野数(D) D= B/C (计算时，要注意 B、C 面积
5、单位要统一)6.测一滴孢子悬浮液中的孢子数(E)用测过滴数的吸管吸取充分摇匀的孢子悬浮液一滴滴于载玻片上，盖上测过面积的盖玻片，在测视野面积的所用的物镜和目镜倍数下镜检，查数 10 个视野的孢子(10 个视野的位置如图示)求出平均一个视野的孢子数(F)。那么，一滴孢子悬浮液中所含的孢子数(E)就等于平均一个视野的孢子数(F)乘以盖玻片所含视野数(D)之积，即 E=FD。因为盖玻片下孢子悬浮液液层尽管很薄，但仍有一定的厚度，所以查数孢子要注意调节显微镜的微动螺旋，以免漏掉不同层次内的孢子，此外，为了避免倾向性，转换视野时，镜检视野位置顺序示意图。眼睛需离开目镜。7.求平均每粒麦种上所带的孢子数(
6、G)，平均每粒麦种上所带的孢子数就等于一滴孢子悬浮液中的孢子数(E)乘以所用吸管 1 毫升蒸溜水的滴数(A)之积，再除以种子粒数 100。三、作业和思考题1试将豆种和麦种肉眼检验及小麦腥黑穗病洗涤检验的结果写成报告。2试讨论洗涤检验应用的范围，从本次实验分析洗涤检验尚存在的哪些问题?怎样加以克服和避免?3设计棉花枯、黄萎病、炭疸病的种子检验方法。附：真菌孢子的计数计计数法真菌孢子计数的方法很多，如本次实验检验种子带菌量所用的方法就是其中的一种。此外，计数计计数法更为常用，而且计数准确，计数计的种类很多，如下仅概要介绍纽鲍尔(Neubauer)血球计数计法。血球计数计是一块很厚的载玻片，上面划有
7、边长为 1 毫米的大方格，1 毫米边长又均等为20 等分，于是构成 400 个边长的 0.05 毫米的小方格，每小方格的面积为 0.0025 平方毫米，加盖玻片后，小格的深度是 0.1 毫米，所以每小格的容积是 0.00025 立方毫米，即 0.00000025 毫升(或 1/4000000 毫升)，计数时，先将盖玻片放在血球计数计能上能下有刻度的位置，从盖玻片的一侧加经适当稀释(使每小格中有 5 个左右的孢子)的孢子悬浮液，然后在显微镜下查数每小格中孢子的数目，根据情况查数 1620 小格内的孢子数，这 1620 小格要分布在 400 小格的 4 个角上或对角线 5 点位置上，即要有代表性，以每小格平均孢子数乘以 4000000，就是每毫升悬浮液中孢子的数目。
