1、稳定同位素样品取样方法讲座大纲林光辉 陈世苹中国科学院植物研究所 北京 100093第一部分 固体样品采集1 植物水分利用效率的研究：取样部位：叶片测定指标： 13C基本原理： 13C 分析是评估 C3 植物叶片中细胞间平均 CO2 浓度的有效方法。根据 Farquhar等(1982)，植物的 13C 值可由下式来表示：13C p= 13C a-a-(b-a)Ci /Ca 式中， 13C p 和 13C a 分别为植物组织及大气 CO2 的碳同位素比率， a 和 b 分别为 CO2 扩散和羧化过程中的同位素分馏，而 Ci 和 Ca 分别为细胞间及大气的 CO2 浓度。可明显看出，植物的 13C
2、 值与 Ci 和 Ca 有密切的联系。植物组织的 13C 值不仅反映了大气 CO2 的碳同位素比值，也反映了 Ci /Ca 比值。C i /Ca 比值是一重要的植物生理生态特征值，它不仅与叶光合羧化酶有关也与叶片气孔开闭调节有关，因而 Ci /Ca 值大小也与环境因子有关。另一方面，根据水分利用效率的定义，植物水分利用效率也与 Ci 和 Ca 有密切的联系，这可由下列方程式中看出：A= g(Ca-Ci)/1.6E= gWWUE=A/E= (Ca-Ci)/1.6W 式中，A 和 E 分别为光合速率和蒸腾速率， g 为气孔传导率，而 W 为叶内外水气压之差。这样， 13C 值可间接地揭示出植物长时
3、期的水分利用效率：WUE=1313()/.6apab由于植物组织的碳是在一段时间（如整个生长期）内累积起来的，其 13C 值可以指示出这段时间内平均的 Ci /Ca 值及 WUE 值。注意事项： 阳生叶片； 光合活性强的叶片（避免新生和衰老叶片） ； 比较不同种或不同地区植物的水分利用率时应注意大气 CO2 本底的 13C 值与气候和水分条件是否接近。特别是在森林生态系统中，植物叶片 13C 值存在明显的冠层效应，即愈接近森林地表，植物叶片的同位素贫化（isotopic depletion ）效应愈明显，产生这一效应的原因主要有两个：一个是林冠内部形成的光强梯度，光强下降导致较高的Ci/Ca；
4、第二是林下植物和土壤呼吸释放含有较低 13C 的 CO2。前处理：尽可能立即烘干；测定前要粉碎过 6080 目筛难题：高大乔木取样；地理跨度很大或气候条件差异明显的地点间的比较2 植物光合类型的判定取样部位：叶片测定指标： 13C基本原理：植物光合作用是自然界产生碳同位素分馏的最重要过程。目前大气 CO2 的13C 值为 8左右。大气 CO2 经气孔向叶内的扩散过程、CO 2 在叶水中的溶解过程，以及羧化酶对 CO2 的同化过程，均存在由显著的碳同位素效应（Farquhar et al., 1989） 。而且，不同光合途径（C 3、C 4、和 CAM）因光合羧化酶（RuBP 羧化酶和 PEP
5、羧化酶）和羧化的时空上的差异对 13C 有不同的识别和排斥，导致了不同光合途径的植物具有显著不同的 13C 值。在陆生植物中，C 3 植物的 13C 值由-20到-35（平均为-26） ，C4 植物由 -7到-15（平均为-12 ） ，而 CAM 植物由-10到-22(平均为-16), 因此 13C 值可用来鉴别植物的光合途径。注意事项：阳生叶片；光合活性强的叶片。难题：对一些中间类型或 CAM 光合途径兼有的物种的判断比较困难3 植被变迁取样：植物叶片或植株、土壤、花粉粒、动植物化石等测定指标： 13C基本原理：不同光合类型植物的 13C 值之间存在很大差异，土壤有机质、花粉粒以及动植物化石
6、 13C 值中包含了不同地质年代的植被光合类型等方面的信息，如土壤有机质是由分解的植物残体逐渐转化和积累起来的，所以土壤有机质同位素组成与其上的植被同位素组成有直接的关系，因此可以用来判断植被的变迁，主要是 C3/C4 植物的构成比例。哺乳动物牙齿的釉质层，特别是食草动物的食物同位素组成比较规律和稳定，所以牙齿化石釉质的稳定同位素分析对于判断古气候变化非常有用。注意事项：植物取样同上；土壤根据具体情况取不同深度的样品，浅表土壤尽量划分的细些，如 0-2 cm, 2-5 cm, 5-10 cm 等，最表层土壤容易受到人类和生物活动的干扰，所以一般表土样品采集地表下 2-3cm 的土壤，此层土壤中
7、的有机质组分经过了长时间的分解，达到了稳定。前处理：植物样品处理同上；一般土壤样品需要研磨过 80-100 目筛，如果是碱性土壤需要酸化，即用过量的稀释 HCl（ 2 mol/L）处理土壤样品 24 小时，以除去土壤中的碳酸盐。去除土壤中碳酸盐主要是因为土壤中的碳酸盐不仅容易受成岩作用影响，而且这些碳酸盐从形成起直到今天一直在与地层中的 CO2 气体反应，因此这种来源的同位素分析很难真正反映地质历史时期的气候状况。难题：此方法只适于原始与现代植被类型间 13C 差异较大的地区，如由 C4 草原转变为 C3灌丛；由 C3 草原转变为 C4 植物为准的农田（玉米、甘蔗等） 。当分析花粉粒、动植物化
8、石样品时常需要特殊的仪器（样品量太小） 。而对化石材料分析的很大困难应该是如何准确确定它所处的地质年代（ 14C 定年） 。4 长期气候变化取样：树木年轮、湖泊沉积物、动植物化石、石笋、冰芯等，时间尺度从几十年到几百万年测定指标： 13C、 18O、D基本原理：树轮是能提供各种环境气候信息的生命体, 树木在光合作用过程中吸收的 CO2和 H2O 是树轮有机组成中 C、H 、O 的唯一来源, 因而树轮 C、H 、O 同位素组成应能反映树木生长时大气圈 (CO2) 和水圈 (H2O) 的同位素组成特点。同时, 光合作用过程也是一个受环境气候因子制约的同位素分馏过程,经过这一过程的树轮同位素组成,
9、也应记录有树轮生长时气候因子的信息。比如：树木年轮的 13C 值可以用于大气 CO2 浓度、大气温度、大气相对湿度和降水量等环境因子的重建。目前越来越多的研究同时应用两个或多个同位素共同解释气候的变化，增加了结果解释的精确度。前处理：提取年轮中的纤维素难题：年轮的准确定年；树轮纤维素的硝化5 植物氮素利用取样部位：植物叶片、土壤测定指标： 15N基本原理：大气 N2 的 15N 值接近 0，而土壤 N 的 15N 值在-6 至 16之间（参见补充材料 1） 。因此，主要通过固氮作用从大气中获得氮素的植物 15N 丰度应该接近 0；而且通过计算也可以定量非固氮植物所利用的氮源的构成比例。注意事项
10、：光合活性强（避免新生和衰老叶片） ；土壤取样采集根系较集中的土层。难题：土壤中氮转化过程同位素效应很大，且常常不同方向，因此造成土壤 N 的 15N 值变化范围很大，为了更加准确的确定植物的氮素来源，通常可以通过添加 15N 标记的氮素的方法；土壤氮含量有时太低，需要较大的样品（消耗更多的耗材等） 。6 植物水分来源：见下节液体样品采集第二部分 液体样品采集1 植物水分来源基本原理：植物中氢和氧的主要来源是水，植物所能利用的水分主要来自降水、土壤水、径流 （包括融雪）和地下水。土壤水、径流和地下水最初也全部来自降水, 但由于土壤水分输入的季节变化、地表层的蒸发或土体水分和地下水之间的差异使得
11、土壤水分产生同位素组成梯度。一般来说，植物根系吸收水分过程以及随后的木质部水分运输过程均不发生同位素分馏效应，即根的和茎内水的D 、 18O 值与土壤中可供植物吸收的水之D、 18O 值相近。因此我们可以通过分析植物茎水的同位素比率来确定根系对不同来源的土壤水的吸收，可以使我们进一步地了解根在土壤剖面中的活动和在自然群落中植物对水分的利用的差别。在整个生长过程中，植物可能不仅仅利用一种水源（包括大气降水、土壤水、地下水等） 。利用稳定同位素技术不但可以测定植物在不同环境下所利用水分的深度并且对使用两个以上水源的植物可以定量其所利用水源所占的比例；而且还可以研究植物水分利用在时间上的变化，这一点
12、是仅通过分析植物根系在土壤剖面中的分布所不能确定的。同位素技术的另一个重要作用是确定在土壤中哪部分植物根系是吸收水分的最活跃区域。因为植物根系通常遍布整个土壤剖面，但这并不意味着根系在其存在的土层中都表现出水分摄取活性，到目前为止其它方法则难以解决这一问题。Figure Hydrogen isotope ratios of water fond in plants growing in the same arid land location in southern Utah following an intense summer rain event. Shown also are the o
13、bserved variations in the isotopic composition of summer rains (upper depth soil moisture source) and winter rains (lower depth soil moisture sources). 引自 Ehleringer et al. 1991.1） 植物样品的采集：乔木和灌木：非绿色的枝条；草本：根茎结合处的非绿色部分；注意事项： 非绿色部分没有气孔不会发生蒸腾作用； 当取灌木和乔木等有明显韧皮部的植物样品时，应将韧皮部（即树皮）迅速剥离； 采样量根据植物的含水量有所不同，一般以能够
14、提取 0.1-0.3 ml 水为宜（如 34cm 长的枝条 23 支即可） ，不宜过多也不宜过少。样品取样过多将导致抽提时间过长，并容易造成抽提不完全而影响结果；过少则有可能很难获得足够测定的水分。 取样要迅速，取样完毕后样品瓶需要立即用 parafilm 密封，然后冰冻保存。 2）潜在水源样品的采集：包括：大气降水：降雨或降雪；土壤水：土壤的采样最好是采集根系较集中的土层；也可以采集土壤剖面，浅层土壤采集则要注意不要采集暴露在空气中的表层土壤，最好是采集表层 2cm 以下的土壤。地下水：深层土壤或井水；其它水源：如灌溉水、河流或溪流水等注意事项：所有采集的水分样品瓶都需要立即用 parafi
15、lm 密封，然后冰冻保存。2 大气中水汽样品的采集采样方法：冷阱法，即高纯度酒精和液氮混合物，低于-70 摄氏度左右）采样装置基本由以下几个部分组成：注意事项： 采样点要尽量放置在高处，避免人为和其它水汽来源的潜在影响； 要监测并保持冷阱温度；气泵流量计冷阱空气 采样时空气的流速不能太快，一般在 0.2 L/min 左右，过快将使得空气中的水汽不能完全被冷阱冰冻下来，从而导致水汽同位素分馏； 采集后的样品要立即密封并低温保存。在干旱地区采样时间要适当延长，可以延长至 2-3 个小时。第三部分 气体样品采集1 本底大气 CO2 同位素组成采样方法：首先应该将气瓶抽真空，然后在空旷的、相对较高的地
16、方将气阀打开，待瓶子内外气压平衡后即可。注意事项：需要尽量减少人呼吸、植物光合或土壤呼吸的影响，特别是在森林中的取样，要注意由于冠层效应造成的 CO2 浓度梯度。2 生态系统呼吸组分的区分（Keeling 曲线）注意事项：要在静风或风速较小的条件下取样，以确保可以得到比较稳定的 CO2 剖面。难题：在草原生态系统干旱条件下，很难获得足够大的 CO2 浓度剖面，一般 CO2 浓度差要达到 50-70ppm。3 CH4 和 N2O 等温室气体排放来源采样方法：静态箱法，用气袋采集箱内的气体样品。稳定同位素技术在其它方面的应用1 在动物生态学研究中的应用 动物的食物来源 动物的营养级位置 食物链和食物网研究 动物分布格局和迁徙活动2 在环境科学研究中的应用 有机质和污染物来源的追踪引自 Ehleringer, JR and TE Cerling. 2001. Stable isotopes. In: HA Mooney and J Canadell (eds.), Encyclopedia of Global Environmental Change, Volume II, John Wiley and Sons, London. pp. 544-550.补充材料1
