1、猪乙脑病毒 RT-PCR 检测方法编制说明日本乙型脑炎又名流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis），是由日本乙型脑炎病毒引起的一种急性人兽共患传染病。猪主要特征为高热、流产、死胎和公猪睾丸炎。乙型脑炎是自然疫源性疫病，许多动物感染后可成为本病的传染源，猪的感染最为普遍。本病主要通过蚊的叮咬进行传播，病毒能在蚊体内繁殖，并可越冬，经卵传递，成为次年感染动物的来源。由于经蚊虫传播，因而流行与蚊虫的孳生及活动有密切关系，有明显的季节性，80%的病例发生在7、8、9三个月；猪的发病年龄与性成熟有关，大多在6月龄左右发病，其特点是感染率高，发病率低(20%-30%),死亡率低；新疫区
2、发病率高，病情严重，以后逐年减轻，最后多呈无症状的带毒猪。JEV属于黄病毒科，黄病毒属、基因组为单分子线状正股单链RNA，球形，有囊膜，直径约为40 nm，基因组全长为11kb。病毒仅有一个开放阅读框（open reading frame,ORF），包括 3个结构蛋白基因：核衣壳蛋白（C）、膜蛋白(prM)、囊膜糖蛋白(E) ，7个非结构蛋白基因（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5）和2个非翻译区。根据核苷酸和部分氨基酸序列确定的基因组顺序5-C-PrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3。JEV可与引起妊娠母猪出现流产或产死胎、
3、公猪睾丸炎和仔猪脑炎等，给养猪业造成了巨大的经济损失。更为严重的是，猪可以作为JEV的储存和增殖宿主，在传播媒介蚊的作用下，可以使JEV 在猪和人之间互相传播，JEV不仅给养猪业带来了巨大损失，而且JEV在猪群中的流行也给人类的安全健康带来了巨大的威胁，因此，建立一种快速、准确、方便的方法来监测JEV在猪群中的流行情况，具有重要的经济价值和公共卫生学意义。目前已有的JEV的检测方法主要有病毒分离鉴定、免疫荧光法( IF) 、免疫组织化学技术( IHT) 、免疫电镜法( IEM) 、HI/HA、中和试验和ELISA 等方法，这些方法存在操作繁琐、技术要求和试验条件要求高、试验周期长等缺点，难以满
4、足临床上快速、大量检测的需要，因此急需要研究一种快速、高效、特异、敏感的检测方法。聚合酶链式反应（PCR）诊断技术是近年来新发明依靠体外扩增病原核酸 DNA 序列而进行病原学诊断的高科技技术，其优点是不需要进行病原的纯化培养，而且操作简便快速、特异性好、灵敏度高，适用于疾病的病原学诊断，已成为当前临床多种疫病快速检测诊断的重要方法，目前成为疫病快速诊断最常用的方法之一。本标准根据 GenBank 猪乙脑病毒的基因组中 E 基因DNA 序列自行设计引物，对疑似猪乙脑病毒感染猪样品进行了 PCR 扩增，并对临床上易与猪乙脑病毒发生混合感染或临床症状易混淆的其他病原基因组进行了对照特异性扩增试验，最
5、后通过对 PCR 产物的克隆测序，表明所建立的PCR 诊断方法特异性好，可以作为确诊感染猪乙脑病毒的实验室检测方法。该技术标准具有实用性和可操作性，若采纳、颁布实行后，可以对猪乙脑病毒的感染进行快速准确的实验室诊断，从而及早进行对症治疗，及时控制疾病，降低经济损失，减少人感染的机率，具有重要公共卫生意义。按河南省质量技术监督局关于下达 2014 至 2015 年度地方标准制修订计划的通知（豫质监标发2007525 号）的要求，根据我中心的研究及应用经验，起草了猪乙脑病毒 PCR 试验方法 。该技术标准具有实用性和可操作性，若采纳、颁布实行后，将为我国 JEV 的临床快速确诊和跨省调运工作提供技
6、术保障。一、工作简况，包括任务来源、起草单位、主要工作过程、主要起草人及其所做的工作1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件河南省质量技术监督局关于下达 2016 年第一批河南省地方标准制修订计划的通知（豫质监标发2016127 号）的要求，由河南省动物疫病预防控制中心负责对河南省地方标准猪乙脑病毒RT-PCR 检测方法 的起草、制定工作。2、起草单位：河南省动物疫病预防控制中心。3、主要工作过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：猪乙脑病毒 RT-PCR 检测方法的建立 1. 引物设计 参考已发表的文献，从 GeneBank 下载猪乙脑病毒 E 基因序列。根据猪乙脑病毒 E 基因中的保守
7、且特异性序列，针对 JEV E 基因 5端核酸序列设计扩增314bp 大小的特异性引物对。2. RT-PCR 方法参数的优化 对疑似 JEV 感染的样品提取 RNA 并反转录，使用 314bp 大小的特异性引物对进行 PCR 扩增，对 PCR 产物进行克隆测序，制备含 JEV E基因的重组质粒作为标准品，将标准品以 1.01001.0109倍倍比稀释作为模板扩增，验证该方法的敏感性；采用 RT-PCR 方法扩增猪乙脑病毒（JEV）猪丙型肝炎病毒（HCV）、牛病毒性腹泻病毒（IBDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV ），验证该方法的特异性；对 1.01061.0103 个拷贝/
8、L 的标准品进行 3 次重复测定，检测其稳定性和重复性；将该方法检测出的阳性样品进行目的基因的克隆测序和病毒分离试验，验证所建立方法的准确性。试验结果证明所建立的猪乙脑病毒 RT-PCR检测方法特异性好，敏感性强，可以作为确诊 JEV 感染的实验室快速检测方法。第二阶段：猪乙脑病毒 RT-PCR 检测方法应用实验 本阶段主要进行猪乙脑病毒 RT-PCR 检测方法试剂盒的组装及在河南省范围内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省动物疫病预防控制中心组装猪猪乙脑病毒 RT-PCR 检测方法试剂盒，并由河南省 18 个省辖市和 2 个省直管试点县（市）动物疫病预
9、防控制中心进行临床样品检测应用试验。共对来自全国 7 个省（主要样品来自河南省）共计 896 份疑似JEV 感染样品进行了应用检测；对其中 12 份样品进行了病毒分离鉴定和阳性样品的克隆测序对照试验。18 个省辖市和 2 个省直管试点县（市）动物疫病预防控制中心参与实验人员对该诊断方法包括试剂盒的组装、反应条件的优化等提出了不同的修改意见和建议；对该方法的准确性、特异性、敏感性等进行了充分实验并得出了肯定意见。第三阶段：标准的起草、修改与制定 根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、科学分析的基础上，组织有关专家起草了猪乙脑病毒 RT-PCR 检测方法 河南省地方标准草案，规定了诊
10、断范围、样品采集及处理方法、实验操作方法、结果判定标准等，并将标准草案送有关兽医专家征求意见，按照专家意见对标准草案进行多次修改完善，制定了当前的猪乙脑病毒 RT-PCR 检测方法（草案）。4、主要起草人及其所做的工作项目主持人：闫若潜，河南省动物疫病预防控制中心，主持本项地方标准的制定与编写。主要起草人：班付国：河南省动物疫病预防控制中心，负责标准的制定和试验技术推广。曹伟伟：河南省动物疫病预防控制中心，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。马震原：河南省动物疫病预防控制中心，负责标准的制定和检测方法的优化。陈悦：郑州市畜牧技术推广站，负责此标准方法的推广。王淑娟：河南省动物疫病预防控制中心
11、，负责标准的制定、校订和优化。王英华：河南省动物疫病预防控制中心，负责标准的校订负和测方法的建立。二、地方标准编制原则和确定地方标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据） ，修订国家标准时，应增列新旧国家标准水平的对比按照标准编制的有关要求，以河南省动物疫病预防控制中心为主要组织者，以 18 个省辖市和 2 个省直管试点县（市）动物疫病预防控制中心为主要参与单位，通过对来自 7 个省的大量临床疑似样品进行检测应用，结合临床症状及与其它方法的对照试验，同时经征求国内相关专家意见，对获取的实验数据进行科学统计分析，力求标准客观公正、真实科学、
12、易于操作、便于推广，体现先进性，增强其指导性。（一）引物优选参考已发表的文献，从 GeneBank 下载猪乙脑病毒 E 基因序列。根据猪乙脑病毒 E 基因中的保守且特异性序列，针对 JEV E 基因 5 端核酸序列设计针对扩增 E 基因 314bp大小的特异性引物对。表 1 引物序列引物 引物序列片段大小上游 5- CATCCAACTCAACCGCAAGTC-3引物对 下游5-GGGCTAGGTTACTGTCATCTTC-3314bp2. RT-PCR 方法参数的优化N P M图 1 猪乙脑病毒 RT-PCR 方法的扩增图注： P：猪乙脑病毒阳性对照；N：阴性对照；M：DNA Marker D
13、L2000（二）标准方法的特异性利用本标准制定的猪乙脑病毒RT-PCR检测方法扩增JEV、HCV、PRRSV 、CSFV、IBDV等，验证该方法的特异性。 结果显示，该方法能特异性的扩增出JEV条带，但对HCV、PRRSV、CSFV、IBDV等病原扩增不出任何条带，说明标准所规定的诊断方法特异性好。整个实验过程约需12h，操作步骤按常规RT-PCR 方法进行，说明标准规定的方法快速、简便，易于临床检测应用及大范围推广。图 2 猪乙脑病毒 RT-PCR 方法的特异性验证注：P ：阳性对照；N：阴性对照；1：HCV；2：PRRSV；3：CSFV；4：IBDV；1 2 3 4 N P M(三) 标准
14、方法的敏感性RT-PCR 扩增的阳性样品再使用 314bp 大小的特异性引物对进行 PCR 扩增，对 PCR 产物进行克隆测序，制备含JEV E 基因的重组质粒作为标准品，将标准品以1.0100 1.0109 倍倍比稀释作为模板扩增，验证方法的敏感性。结果该 RT-PCR 方法对 JEV 重组质粒检测的最低极限均为 100 个拷贝/L。说明标准规定的方法敏感度好，阳性检出率高，适用于临床样品检测应用。图 3 猪乙脑病毒 RT-PCR 方法的敏感性验证注：P：阳性对照；N：阴性对照；18：浓度依次分别为 107-100copies/L 的重组质粒（四）应用范围利用建立的方法对 896 份疑似猪乙
15、脑病毒感染样品进行检测实验，结果表明，本标准所建立的方法对所有样品1 2 3 4 5 6 7 8 N P M均能进行有效检测。（五）临床应用实验对来自全国 7 个省的 896 份疑似 JEV 感染样品进行了应用检测实验，共检测出 JEV 阳性样品 107 份，检测结果与临床发病症状、病理剖检变化及部分样品的病原分离培养结果等具有较高的符合率，说明标准规定的方法可以进行大范围的推广应用。三、主要试验（验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果：由 JEV 引起的猪乙脑疫病对养猪业危害严重，当前，缺乏快速敏感的诊断 JEV 感染的方法。RT-PCR 诊断方法具有快速、特异、敏感等优点，已
16、在疫病病原学诊断中得到广泛应用，成为动物疫病病原学快速诊断方法之一。本标准所建立的 JEV RT-PCR 方法快速、特异、敏感，对于临床上快速诊断具有重要意义。该标准具有实用性和可操作性，若采纳、颁布实行后，可对 JEV 进行快速准确的鉴别诊断，从而及早进行对症治疗，及时控制疾病，降低经济损失，具有重要意义。四、采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品、样机的有关数据比对：设计引物时根据 GenBank 中已登录的 JEV E 基因的 5端核苷酸序列设计 1 对上下游引物，经反复试验验证后，建立了 JEV RT-PCR 检测方法。用建立的 R
17、T-PCR 诊断方法对 JEV、HCV、PRRSV、CSFV、IBDV 等 5 种对照病原体核酸、已知的 JEV 感染样品、健康猪只组织样品等样品为对照进行特异性检测，证明了方法的特异性。敏感性试验表明该方法最低检测极限为 100 copy/uL。经对采用本标准规定的 RT-PCR 诊断方法检测过的 30份样品（JEV 阳性 23 份，阴性 7 份）进行病毒分离培养对照试验，结果：两种实验方法得到的结果完全一致，二者符合率为 100%。以上实验结果证明了本标准制定的 JEV RT-PCR 方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。五、与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系：本标准是为了更好地
18、贯彻中华人民共和国动物防疫法、重大动物疫情应急条例以及有关的法律法规，加快我国动物防疫标准化工作进程，适应我省猪乙脑病的防控工作需要。六、重大分歧意见的处理经过和依据：在本标准的制定过程中，相关审稿专家没有提出重大分歧意见。七、地方标准作为强制性地方标准或推荐性地方标准的建议：该项技术标准的制定，试验数据充分，科学性强，并经过了长期大量实际应用，可作为河南省推荐性地方标准在猪乙脑的研究、诊断、防治、检疫和流行病学调查工作中进一步推广应用。八、贯彻地方标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法等内容）：建议以培训班的形式推广本标准。 九、废止现行有关标准的建议：无。十、其他应予说明的事项：无。河南省动物疫病预防控制中心标准编制组2016 年 6 月 2 日
