1、DB 41河 南 省 地 方 标 准DB 41/T XXXXXXXXX犬瘟热、犬细小病毒二重 TaqMan MGB 荧光定量 PCR 检测方法（征求意见稿）- XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施河 南 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB41/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，郑州市动物疫病预防控制中心，驻马店市动物疫病预防控制中心，三门峡市动物疫病预防控制中心，鹤壁市畜产品质量监测检验中心，信阳市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：闫若潜
2、、班付国、王华俊、方先珍、刘梅芬、赵明军、张代宝。本标准参加起草人：杨晴、谢彩华、曹伟伟、王淑娟、郭育培、王建科、黄清、韩楠、马超峰、朱前磊。DB41/T XXXXXXXXX1犬瘟热、犬细小病毒二重 TaqMan MGB 荧光定量 PCR 检测方法1 范围本标准规定了犬瘟热（CDV）、犬细小病毒（CPV）实时荧光定量二重PCR试验的样品采集、处理、存放、运输、操作方法及鉴别及结果判定。本标准适用于对疑似CDV、CPV犬唾液、鼻液、眼角分泌物、犬粪便、肠内容物或血清等待检样品中的病毒核酸检测。2 试剂和仪器设备2.1 试剂2.1.1 除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 66
3、82-1992 的 RNase-free 水。提取 RNA 所用试剂均须使用无 RNA 酶的容器进行分装。2.1.2 疑似犬瘟热（CDV）、犬细小病毒（CPV）犬唾液、鼻液、眼角分泌物、犬粪便、肠内容物悬液或血清20 保存，常规试剂（见附录 A）常温保存。2.1.3 裂解液（TriZol），氯仿，1核酸电泳缓冲液，0.01 mol/L（pH 7.2）的 PBS（见附录 A），DEPC 水（二乙基焦碳酸酯处理的水），均应 4 保存。2.1.4 异丙醇，75%乙醇，-20 保存。2.1.5 消化液（见附录 A），TE 缓冲液（见附录 A），常温条件下保存。2.1.6 酚/氯仿/异戊醇混合液(25:
4、24:1) （见附录 B），0.01 mol/L（pH 7.2）的 PBS（见附录 A），阿氏液等试剂（见附录 B），以上试剂 2 8 条件下保存。2.1.7 消化液（见附录 A），置-20 保存。2.1.8 阳性对照样品、阴性对照样品见附录 B。2.1.9 TaqMan RT-PCR 检测用上、下游引物序列参见附录 B。2.1.10 犬瘟热（CDV）、犬细小病毒（CPV） 二重 TaqMan RT-PCR 反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录 C。2.2 仪器设备实时荧光定量PCR仪，高速冷冻离心机（12 000g以上），生物安全柜，恒温水浴锅，2 8 冰箱，-70 冰箱，单道微量移液
5、器（ 0.1 L2.5 L；0.5 L10 L；2 L20 L；20 L 200 L；100 L1 000 L），组织匀浆器或研钵，真空干燥器（非必备）。3 样品的采集、处理、存放及运输3.1 样品的采集及处理DB41/T XXXXXXXXX2采取犬唾液、鼻液、眼角分泌物、犬粪便、肠内容物或血清等样品，将样品一起放入盛有1.0 mL拭子悬液的Eppendorf管中，然后将样品悬液转入无菌Eppendorf管中，4 条件下5 000 r/min-1离心10 min，取上清转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。3.2 存放与运送采集或处理的样品在2 8 条件下保存应不超过24 h；若需长期
6、保存，应放置-70冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。4 操作方法4.1 样品 RNA 的制备4.1.1 分别取灭活的 CDV 细胞培养物、阴性对照及待检样品各 100 L 于 1.5 ml 无 RNA 酶的离心管中；4.1.2 加入 600 L 的 Trizol 于涡旋器震荡 2 min3 min；4.1.3 加入 200 L 氯仿，12000 g 离心 5 min，弃沉淀，取上清转入另 1.5 ml 离心管中，加 200 L 异丙醇沉淀，颠倒数次混匀，-20 放置 20 min；4.1.4 1 2000 r/min -1离心 5 min，
7、弃上清，沉淀用质量百分比 75%乙醇洗涤，干燥；8000 r/min -1离心 10 min，弃上清，沉淀室温干燥 10 min；4.1.5 用 20 L DEPC（焦磷酸二乙酯）水溶解沉淀，取 10 L 用于反转录，其余-70 保存。RNA溶液在 2 h 内进行反转录合成 cDNA 模板。另外，RNA 抽提也可以采用市售的商品化 RNA 抽提试剂盒进行。4.2 样品 DNA 的提取4.2.1 分别取灭活的 CPV 细胞培养物、阴性对照及待检样品（如为组织时先加适量 PBS 研磨后取上清）各 100 L 于 1.5 ml 离心管中；4.2.2 加入 500 L 消化液（含终浓度 10 mM T
8、ris-HCl（pH 8.0）、终浓度 25 mM EDTA（pH 8.0）、终浓度 0.5%SDS（w/v）、终浓度 100 mM NaCl ）和 10 L 蛋白酶 K（终浓度 20 mg/mL）震荡混匀 20 s，置 55 水浴 60 min；4.2.3 1 2000 r/min -1离心 5 min，弃沉淀，取上清，加入等量的 Tris 平衡酚/氯仿/异戊醇（体积比为 25：24：1）混合液，反复颠倒离心管 56 次混匀；4.2.4 12000 g 离心 5 min，吸取上清液加入等体积经-20 预冷的异丙醇，颠倒混匀，1 2000 r/min-1离心 5 min，加入 500 L 质量
9、百分比 75%乙醇洗涤沉淀，1 2000 r/min -1离心 5 min，弃上清，室温干燥 10 min；4.2.5 最后加入 20 L TE 缓冲液溶解沉淀，-20 冻存备用。4.3 反转录（cDNA 的合成）配制反转录反应混合液，向每管中分别加入4.1.5中相应RNA 10 L，并对每个管进行相应的编号，37 水浴1 h或置于PCR仪中 37 1 h，反应结束后，70 15 min 灭活反转录酶，直接用于下面的二重FQ RT-PCR扩增或-20 冻存备用。4.4 二重荧光定量 RT-PCR 扩增DB41/T XXXXXXXXX3在检测区配制与本标准4.1(4.2)中相同数量的实时荧光PC
10、R反应体系n管，向每管中加入4.3和4.2.5中相应cDNA和DNA各2 L，充分混匀后并使液体全部聚集于管底，按照要加样品的顺序摆放好实时荧光PCR反应管。4.4.1 在检测区配制与本标准 4.1(4.2)中相同数量的实时荧光 PCR 反应体系 n 管，向每管中加入 4.3和 4.2.5 中相应 cDNA 和 DNA 各 2 L，充分混匀后并使液体全部聚集于管底，按照要加样品的顺序摆放好实时荧光 PCR 反应管。4.4.2 将本标准 4.4.1 中加样后的实时荧光 PCR 反应管放入实时荧光定量 PCR 仪内并记录样本摆放顺序。4.4.3 反应参数设置：第一阶段，预变性 94 /5 min；
11、第二阶段，94 /30 s，60 /30 s，40 个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，荧光模式设为 FAM/NONE 和 VIC/NONE 双标记模式。5 结果判定5.1 结果分析条件设定读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。5.2 质控标准阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值32.0或无；阳性对照的Ct值应29.0，且出现特定的扩增曲线（参见附录E）；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效。5.3 结果描述及判定5.3.1 阳性Ct值29.0，而且出现特定的扩增曲线，则判定为阳性
12、，如出现两条特定的扩增曲线，则为CDV、CPV双阳性，如出现一条特定的扩增曲线，则为对应的病毒检测阳性。5.3.2 阴性Ct值32.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性。5.3.3 可疑29.0Ct值32.0且有特定的扩增曲线的样品应重做，结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。5.3.4 无效扩增如果阳性对照没有扩增曲线，或者阴性对照有Ct值32.0的扩增曲线，判定本次实验无效，需要分析试验失败原因，并重新试验。DB41/T XXXXXXXXX4A A附 录 A（规范性附录）试剂的配制A.1 拭子悬液的配制在0.01 molL-1 PBS液中添加青霉素、链霉素，抗生素浓度提高5倍；加入
13、抗生素后调pH值至7.27.4。A.2 消化液的配制Tris-HCl（pH 8.0）终浓度10 mmol/L；EDTA（pH 8.0）终浓度25 mmol/L；SDS（w/v）终浓度 0.5%；NaCl 终浓度100 mmol/L。A.3 TE缓冲液的配制Tris-HCl (pH 8.0)终浓度为10 mol/L，EDTA (pH 8.0) 终浓度为1 mol/L。A.4 酚/氯仿/异戊醇溶液的配制Tris饱和酚：氯仿：异戊醇按25:24:1的比例混合。A.5 0.01 mol/L（pH 7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）的配制A.5.1 A液（0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH 2P
14、O4H2O 27.6 g，用适量蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。A.5.2 B液（0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液）： Na2HPO412H2O 71.6 g，用适量蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。A.5.3 0.01 mol/L PBS的配制：A液14 mL，B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL；121 高压灭菌15 min，4保存备用。A.6 消化液的配制称取100 mg蛋白酶K溶解于5 mL灭菌水中。A.7 阳性对照样品经灭活的CDV、CPV细胞培养物。A.8 阴性对照样品正常VERO细胞和正常MDCK细胞。DB41/T XXXXXXXXX5B
15、 B附 录 B（规范性性附录）犬温热、犬细小病毒 TaqMan MGB 荧光定量 PCR 检测方法所用引物犬温热、犬细小病毒TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法所用引物见表B.1。图 B.1 犬温热、犬细小病毒 TaqMan MGB 荧光定量 PCR 检测方法所用引物所用引物引物名称 引物浓度 引物序列PCR扩增上游引物CDV-P1 20 pmol/L 5-ggatggtgcc tgcattgg-3PCR扩增下游引物CDV-P2 20 pmol/L 5-ccgactccag acaatttttt tgt-3PCR反转录引物Unit-P 20 pmol/L Pd（N）9-含有9个碱基的随机
16、序列PCR扩增上游引物CPV-P1 20 pmol/L 5-atgccattta ctccagcagc tat-3PCR扩增下游引物CPV-P2 20 pmol/L 5-ggtatggttg gtttccatgg at-3PCR扩增探针CDV-Probe 10 pmol/L 5-FAM-ctctgagcaa caagaag-MGB-3 PCR扩增探针CPV-Probe 10 pmol/L 5-VIC-agatctgaga cattgggttt-MGB-3 DB41/T XXXXXXXXX6C C附 录 C（资料性附录）犬瘟热、犬细小病毒二重 TaqMan MGB 荧光定量二重 PCR 检测反应
17、混合液组成与说明C.1 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测反应混合液组成犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测反应混合液组成见表C.1。表 C.1 犬瘟热、犬细小病毒二重 TaqMan MGB 荧光定量 PCR 试验反应混合液组成C.2 说明C.2.1 反转录反应混合液成份含：M-MLV 5Reaction buffer(含Mg 2+)，4L；2.5 mM dNTPs，4 L；M-MLV，0.5 L；RNA酶抑制剂，0.5 L；反转录引物（Unit-P）1 L；总体积10 L 。C.2.2 实时荧光定量二重PCR反应混合液成分：10PCR缓冲液(
18、含Mg 2+)，2.5 L；2.5 mM dNTPs，2 L；CDV-P1，0.5 L；CDV-P2，0.5 L；CDV-Probe 1.0 L；CPV-P1，0.5 L；CPV-P2，0.5 L；CPV-Probe 1.2 L；Taq DNA聚合酶，0.25 L ；水，12.25 L；总体积为21 L。C.2.3 DEPC水，用0.1 %DEPC处理后的去离子水，经121 15 min高压处理，用于溶解RNA。C.2.4 反转录反应混合液中分别含有共用反转录引物、反转录酶及各种离子。C.2.5 PCR反应混合液中含CDV和CPV特异性引物对、TaqMan MGB探针、Taq酶及各种离子。组成成分 数 量反转录反应混合液 A 20 管(10 L/管)PCR 反应混合液 20 管(21 L/管）阳性对照样品 1 mL阴性对照样品 1 mLDB41/T XXXXXXXXX7D D附 录 D（资料性附录）犬瘟热、犬细小病毒二重 TaqMan MGB 荧光定量二重 PCR 检测标准扩增曲线犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量二重PCR检测标准扩增曲线见图D.1。注：1. CDV扩增曲线；2. CPV扩增曲线； 3,4. 阴性对照图 D.1 犬温热、犬细小病毒二重 TaqMan MGB 荧光定量二重 PCR 检测标准扩增曲线_
