1、斑点杂交步骤,待测DNA样本：人疱疹病毒1型DNA 寡核苷酸探针： 5- GGCGACTTTGTGTACATGTTCCCGTTTTACGGCTACCGG-3 ， 5端标记地高辛。,斑点杂交步骤D1,1.膜处理：将硝酸纤维素滤膜在双蒸水中充分浸泡，再于20SSC中浸泡1h，夹在两层滤纸中37烘烤20-30min。 2.变性：将待测DNA样品于100水浴10min，立即置冰中。 3.点样：将上述变性后的样品各2l点在已处理的硝酸纤维素膜的毛面上，室温干躁后，于烤箱中80烘烤1-2h。,斑点杂交步骤D2,4. 预杂交：将杂交膜放入可加热封口的塑料袋中，加预杂交液100l/cm2，尽可能赶尽袋中气泡，
2、用封口器将袋口封住。置42恒温水浴摇床轻轻振摇30-60min。 5. 杂交液制备：用预杂交液将探针稀释为25ng/ml，即为杂交液，68水浴10min变性。 6. 杂交：取出杂交袋剪开一角，弃去预杂交液，加入预热至42的杂交液35l/cm2。尽可能赶尽气泡，将塑料袋严密封口。置42恒温摇床上轻轻振摇过夜。,斑点杂交步骤D3,7. 洗膜：剪开塑料袋，小心取出杂交膜，依次用2SSC 、1SSC及0.5SSC溶液，室温下漂洗各10min。 8. 封闭：小心取出杂交膜，在含有3-5ml Washing buffer的平皿中平衡1-5min后，转入3-5ml Blocking buffer中，37作用
3、30min。,斑点杂交步骤D3,9. 酶联抗体结合：将杂交膜封移入一个新的平皿中，加入抗体（抗体稀释方法：取1l Anti-DIG-AP加入5ml Blocking buffer中，轻轻混匀，4 可保存12h），室温孵育30min，经常摇动，使酶联抗体充分与地高辛结合。 10.洗膜：将膜放入含有3-5ml Washing buffer的平皿中，洗膜2次，每次10-15min。再将膜移入含有3-5ml Detection buffer的平皿中平衡2-5min。,斑点杂交步骤D3,11. 显色： （1）将40l NBT/BCIP加入到2ml Blocking buffer中。（显色液必须现配现用） （2）在新鲜制备的显色底物液中静止避光显色（不要摇动）。待膜上出现棕黄色斑点，而本底未显色时，用蒸馏水或TE终止反应。（通常在16h内完成显色反应）,
