1、安徽农业科学，Journal of Ardlui A两Sci2013，41(32)：1260412606 责任编辑陈王敏责任校对卢瑶噬菌体的应用与防治刘秀侠，穆熙军，孙学森，张继晓，迟文超，王兰伟，许燕侠，谷巍(山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院，山东泰安271000)摘要噬茵体结构简单，有严格的宿主特异性，可用于治疗致病茵感染引起的疾病，对医学微生物学、遗传学、分子生物学等学科的发展起到推动作用。噬茵体作为生物界的一员，在自然界中分布极广，给人类生产发酵带来了极为不利的影响。综述了噬茵体的应用前景、潜在风险及防治措施。关键词噬茵体；应用；防治中图分类号$85265 文献标识码A 文章编号
2、0517661l(2013)321260403The Application and Prevention of BacteriophagesLIU Xiu-xia et al (Shandong Baolai-eelai BioIndustrial Group，Taiall，Shandong 271000)Abstract Structure of bacteriophages is simple，and it has strict host specificityIt is widely used in treatment of pathogenic infections，and itpl
3、ays an important role in promoting development of medical microbiology，genetics and molecular biologyAs a member of biology，bacteriopha-ges spread widely in nature，bringing serious impact tO production of fermentationThis article bnefly describes current prospects，potential risksand prevention measu
4、s of bacteriophagesKey words Bacteriophages；Application；Control噬菌体是感染细菌和放线菌等微生物的病毒，最早由英国细菌学家Twoa和加拿大细菌学家Herelle旧1分别于1915年和1917年发现，广泛存在于适合宿主菌生存的泥土、污水和空气等自然界中，对于维持生态系统中不同细菌种类问的动态平衡起到非常重要的作用。噬菌体结构简单、基因数少，是分子生物学及基因工程的良好试验系统。但是，噬菌体的负面作用不容忽视，微生物在工业发酵生产中极易被噬菌体污染，导致发酵异常，造成倒罐的严重损失。笔者探讨了噬菌体在各领域的应用前景及防治措施。1噬茵体
5、的应用11 作为分子生物学研究的试验工具 噬菌体是遗传调控、复制、转录与翻译等方面的生物学基础研究和基因工程中的重要材料或工具“1。遗传学中的转导作用就是以噬菌体作为媒介，在2株细菌间传递遗传物质。12 用于细菌的鉴定和分型 噬菌体只能侵染相应的细菌，具有高度的特异性，可用于细菌鉴定。同时，噬菌体具有型的特异性，可对细菌进行分型鉴定4。目前已经利用噬菌体对沙门氏菌5。、大肠杆菌和伤寒菌等进行分型。13噬茵体展示技术和噬菌体抗体库噬菌体展示技术是一种强有力的基因表达筛选技术，1985年首次由美国科学家SmithMl在(Science)杂志进行了阐述。噬菌体展示技术的基本原理是将外源蛋白的基因克隆
6、到噬菌体的基因组DNA中，从而在噬菌体的表面表达特定的外源蛋白。Ellis SEp。等指出利用噬菌体展示多肽库可以筛选和确定线虫疫苗的抗原，这是疫苗抗原鉴定的一种新方法。近年来随着流行性病毒引起的疾病逐渐增加，抗病毒多肽被认为是预防和治疗疾病极有希望的方法。Castel G旧1等指出噬菌体展示技术特异性表达的重组多肽可以应用到抗病毒研究及药物开发中。作者简介刘秀侠(1988一)，女，安徽淮北人，实验员，硕士，从事分子病毒学及微生态制剂方面研究。收稿臼期201310-08在噬菌体展示技术及PCR克隆技术基础上，英国科学家Winter归1等率先在(Nature)杂志上发表文章阐述噬菌体抗体库技术。
7、该技术是将抗体重链和轻链可变区基因与噬菌体的外壳蛋白基因重组，将抗体片段Fab或scFv与噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式展示于噬菌体颗粒表面，进而快速高效筛选并富集针对某种抗原的特异性抗体，从根本上改变了传统的单抗制备流程。Krishnaswamy驯等利用噬菌体抗体库技术筛选到抗白色念珠菌HM一1杀伤毒素的scFvC1阳性噬菌体抗体，该噬菌体抗体比单克隆抗体结合抗原的特异性高60倍。刑佑尚1等报道了噬菌体抗体库技术在生物寄生虫检测、病毒检测、转基因产品检测、药物残留检测等领域的应用，指出此技术在检验检疫领域具有天然的契合优势和光明的前景。噬菌体抗体库技术必将成为抗体生产的主要技术，将给人类在疾
8、病诊断、肿瘤研究、自身免疫性疾病研究、基因治疗、疾病防治和发病机制等方面带来极为广阔的前景。14用于检测和控制致病菌食品和环境中存在许多致病菌。研究表明噬菌体能够检测和控制食品和环境中致病菌及腐败菌的生长。Bmvko LYu引等讨论了噬菌体检测致病菌的优缺点，指出利用噬菌体检测食品安全及加工制造过程等方面存在的致病菌具有极大的应用前景。姜琴u到等指出利用噬菌体可以实时、快速而准确地检测食品中的沙门氏菌，在公共和食品卫生、畜牧兽医和121岸检疫中具有重要的意义。刘心妍41认为噬菌体不仅可用于检测食源性致病菌，还可以应用在原料采集环节杀灭病原菌、生产或加工环节对设备等进行消毒、延长食品储藏期、消毒
9、新鲜水果蔬菜等方面。15 噬菌体疗法在各领域中的应用 噬菌体在宿主细胞中生长繁殖，能够引起致病菌的裂解，降低致病菌的密度，从而减少或避免致病菌感染或发病的机会，达到治疗和预防疾病的目的，即噬菌体疗法“。此疗法已广泛应用于兽医、农业万方数据41卷32期 刘秀侠等噬茵体的应用与防治和食品微生物学等领域。151噬菌体疗法在畜牧业中的应用。国内养殖业尤其是养鸡业常常受到畜禽肠道腹泻病的困扰，此病主要是由大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物引起“。随着耐药性细菌的大量出现，用具有专一性强、不易产生抗性等优点的相关噬菌体来治疗细菌疾病受到重视。Smith1和Barrow8】等利用噬菌体疗法可以降低羊羔、仔猪和雏
10、鸡患大肠杆菌肠道疾病的机率。152噬菌体疗法在水产养殖中的应用。爆发性疾病的频繁发生给水产养殖业造成巨大的经济损失，细菌性疾病噬菌体疗法在水产养殖业具有良好的应用前景。Park引等在治疗Pseudomonas plecoghssicida等病菌引起的细菌性血型腹水感染时，通过喂食含噬菌体的食物可以有效清除致病细菌。153噬菌体疗法在治疗人类疾病中的应用。噬菌体疗法首先在人类疾病治疗中得到应用。1921年，Bruynoghe和Maisino率先用噬菌体制剂治疗葡萄球菌引起的皮肤感染。此后噬菌体广泛应用于耳喉科、口腔科、眼科、皮肤科、儿科及肺部疾病等的治疗。随着抗生素的出现，噬菌体疗法被渐渐忽视。
11、Kutter E口u等报道噬菌体疗法治疗或预防人类疾病具有极大的潜力，指出通过实践和试验等方法最终使噬菌体疗法商业化是避免此疗法被忽视的关键。随着细菌抗生素耐药性的广泛存在，在许多领域使用噬菌体控制致病菌的生长和扩增。噬菌体治疗能够避免肠道菌群失衡，保持机体的正常免疫力，被认为是替代抗生素的一种安全、有效和有潜力的微生态制剂忸1。2噬菌体的危害与防治噬菌体作为一种宝贵的生物资源已被广泛应用于科学研究中，给人类带来了许多具有实用价值的科研成果。然而，由噬菌体引起的宿主病害可对人类健康、畜牧业、栽培业和发酵工业等带来不利的影响旧。21传统的噬茵体防御方法 国内发酵生产中大多采用传统的噬菌体防御方法
12、(如环境消毒、菌种轮换、选育抗噬菌体菌株及利用药物防治噬菌体)，这些方法只能在一定程度上控制噬菌体的污染。22有效的现代噬菌体防御方法221质粒抗噬菌体体系。某些质粒DNA能指导合成细胞表面抗原或介导产生遮蔽噬菌体吸附受体的胞外糖类，从而有效地抑制噬菌体吸附，且多数质粒可在不同宿主间转移，应用广泛。Tuncer Y和Akcelik M。报道L lactis MPL56的质粒可以编码能抑制噬菌体吸附的蛋白。222限制修饰系统。注入宿主细胞的大部分噬菌体DNA可被宿主细胞限制修饰系统中的限制酶消化，携带有RM系统的质粒可以使宿主细胞抵抗更广泛的噬菌体侵染。2003年，Gabs S和Josephse
13、n J。报道将L Lacts W9菌野生型质粒pAIcat4中的RM系统LlaAl转入宿主菌，极大地提高了宿主菌在牛奶发酵过程中抵挡噬菌体感染的能力。223阻止噬菌体DNA的注入。一些宿主菌能够阻止噬菌体DNA通过宿主细胞膜转运到细胞质，从而成功抑制噬菌体感染宿主菌，这是针对噬菌体早期感染的抑制作用。McGrath3等在噬菌体Tuc2009中发现能够阻止其DNA注入宿主细胞的基因se2009。224流产感染系统。噬菌体DNA注入到宿主细胞后，在噬菌体DNA复制、转录、蛋白表达及包装病毒颗粒等阶段引起被噬菌体感染细胞的大量死亡。此系统多为质粒编码，少数存在于染色体中。Domingues S口刊等
14、报道Izwtococcuslactissubspcremoris IIA20菌株的野生型质粒plL2614中存在对噬菌体936具有有效抑制作用的abiP基因，此基因影响噬菌体DNA的复制和转录。225反义RNA技术。当对目标噬菌体的基因序列有所了解时，将噬菌体的非编码链即反义DNA与质粒相连，转入宿主细胞，由此得到的反义RNA与侵人宿主细胞的噬菌体DNA或RNA互补配对，形成不稳定的杂合体快速降解，从而达到抗噬菌体的目的。2002年，Sturino JM和KlaenhammerTR【嚣。将Sthermophilus噬菌体靳21 DNA保守区域克隆到质粒中，从而抑制Sthermophilus噬菌
15、体的扩增。噬菌体污染问题至今尚未完全解决，采取一些防治措施虽有一定的成效，但要防治噬菌体的污染必须确立防重于治的观念，如决不使用可疑菌种、严格保持环境卫生、选用3040 Ill高空空气再经严格过滤等。3小结噬菌体与人类实践的关系极为密切。噬菌体可用于生物防治、疫菌生产和作为遗传工程中的外源基因载体等，直接或间接地为人类创造出巨大的经济效益、社会效应和生态效应。同时，随着环境治理、生产管理和基因工程重组等技术的完善，人类可以有效地控制噬菌体对生产发酵的污染。因此，噬菌体作为生物的一大类，需要人类予以高度重视，具有广阔的研究及应用前景。参考文献1TWORT F WAn investigation
16、on the nature of ultra-microscopic virusesJLancet，1915，186(4)：124112432DHEREIXE M FOn an invisible microbe antagonistic to dysentery bacilliJComptes Rendus Aeademie Des Sciences，1917，165(3)：3733753刘明河细菌病毒一噬菌体的应用概况J微生物学杂志，2002，22 (4)：56614江艳华，姚琳，王鹏，等噬菌体及其裂解酶在食源性致病菌检测和控制中的作用J微生物学通报，2011，38(10)：1561157
17、15CHO s，WHITIAM T S，BOXRUD D J,et a1Use ofmultiplelocus variablenumber tandem repeat analysis and phage typing for subtyping of Samo-nela Enteritidis from sporadic hum all cas目in the United statJJour-rIal of Applied Miembiolagy，2010，108(3)：8598676SMITH G PFilamentous fusion phage：novel expression ve
18、ctors that display cloned antigens on the vifion surfaceJScience，1985，228：131513177ELLIS S E，NEWIANDS G F J，NISBET A J，et a1Phage-display hbrarybiopanning as a novel approach to identifying nematode vaccine antigemJParasite Immunology，2012，34：2852958CASTEL G，CHT丘OUI M，HEYD B，et a1PIla即display of com
19、binatoriaXpe州de libraries：application to antiviral researchJMolecules，2011，16(5)：M99-35189WARD E S，GUSSOW D，GRIFFITHS A D，et a1Binding activities of arepertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Esche-richia coliJNature，1989，341：54454610KRISHNASWAMY s，KABIR M E，MIYAMOTO M，et a1
20、Cloning anti-fungal single chain fragment variable antibodies by phage display andcompetitive panning elufionJAnalytical Biochemistry，2009，395(1)：16万方数据12606 安徽农业科学 2013盎一2411邢佑尚，汪琳，趔青I|i军，等噬菌体抗体库及其在检验检疫中的应用J检验检疫学刊，2012，22(5)：535712BROVKO L Y，ANANY H，GRIFFrrHs M WBacteriophages for detection and con
21、trol of baeterial patll珥；erls in food and foodprocessing environment【J IAdvances in Food and Nutrition Research，2012，67：24l一2船13姜琴，蒋鲁岩，黄克和利用噬菌体快速鉴定沙门氏菌的研究J微生物学通报，2007，34(q：1138114114刘心妍噬菌嫩在食品安全中的应用和潜在风险J微生物学通报，2011，38(6)：916-92015钱震雯，岳启安，田凤丽噬菌体治疗的研究溉况J医学综述，2007，13(161：1256125816栗艳鸡致宿性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析
22、J畜禽业，2013(10)：121317SMITH H W，肿GGINS M BEfecfiveness of phages in experimental Ecoi diarrhea in calves，piglets and蛐JJournal of General Micronolngy1983129：296918BARROW P，LOVELL M，BERCHIERI A JUse oflytic bacteriophage forcontrol of experimental虽曲日抛coi septicemia and meningitis inchickens and calvesJC
23、linical and Diagnostic Laboratory Immunology，N98，5(3)：29429819】PARK SC，SIlIMAMIIiA I，FUKUNAGA M。et a1IsolatiOn of bacterio-phages specific to a fish pathogen，pseudomenas plecngtossieida，a Can-didate for Disease ControlJApplied and Environmental Microbiology。加66：1416142220】CHANISHYII工N，CHANISHVILI T，
24、TEDIASHVILI MPhages and theirapplicaion against drugresistant ba|ct商aJJoumal of ChemicalTechnology and Biotechnology。2001，76：689-69921KUTFER E，DE VOS D，GVASALIA G，e【a1PI呼therapy in clinicalpractice：treatment of human infectioml J 1Current Pharmaceutical BiO-technology，2010，11(1)：698622景绍红，胡占云抗生素替代物在
25、养猪生产中的应用J猪业科学，2011(5)：788023周德庆微生物学教程M2版北京：高等教育出版社，1993：758124YASIN T，MUSTAFA AA protein which masks galaetose receptor rIledia-ted烁susceptibility in厶耐lactissubsp1actismLS6JIn-ternational Journal of Food Science and Technology，2002，37(2)13914425GABS S，JOSEPH,SEN JImprovement 0f phage ddence inactoco
26、ctmacts by introduetiOil of the plasmid encoded restriction and modificationsystem Ha AIJLetters in Applied Microbiology，2003，36：33233626MCGRATH s，VAN SINDEREN D，FrlZGERALD G FB瞅耐惭de-rived genetic tools for uinactc acd bacteriaf JIntemational DairyJoumal，20吃，12：1315【刀I DOMINGUFS，CHOPIN A，EHRLICH S D
27、。et a1The l_actoccccd abor-rive phnse infection system AbiP prevents both phase DNA replicationand temporal transcfipfiOn switchJJournal of Bacteriology，2004，186(3)：71372128 s兀lIN0 J MKLAENHAMMER T RExpression of antisense RNA a-sainst断咧M t蛔m枇bacteriophagesJAppliedEnviron-mental Microbidngy，2咙，鹤：588
28、596。+。+-。+。+。卜”+_。卜”卜。+。+。+-+一+-+一+一+-+*+一+-+*+一+-+一+-+*+-+一+一+-+-+一+一+-+-+一+*+一+一+-+一+-+一+-+-+(上接第12587页)215土壤速效钾。由表4可知，标准农田的土壤速效钾平均值为845 m#ks，比1984年提高了119 mgkg，潜在缺钾(80100 mgkg)、缺钾(5080 mgkg)和极缺钾(50mgkg)的面积均比1984年有所减少，但是相对缺乏的状况依然没有根本改善。表4 湖州市标准农田土壤速效钾含量及比例22 标准农田等级根据湖州市各县(市区)标准农田地力调查汇总资料，996的标准农田为一
29、、二等田，与浙江省85左右的标准农田为二、三等田H1相比，湖州市标准农田质量整体较好。其中，一等一级田占39，一等二级田占427，二等三级田332，二等四级田占198，三等五级田占04，三等六级田没有。湖州市的一等田主要位于吴兴区、南浔区、德清县东中部和长兴东部，绝大部分二等田分布于德清西部、长兴县的中西部和安吉县的大部，与地貌类型分布一致。3结论与讨论(1)土壤化学性质。调查结果表明，土壤酸化趋势明显，有机质较丰富，普遍缺磷，缺钾较重。(2)地力等级。湖州市标准农田质量整体较好，综合地力等级以一等、二等为主。(3)增施有机肥。土壤有机质含量虽然较丰富，但有下降趋向，应通过秸杆还田、增施有机肥
30、等措施防止进一步下降。(4)补充磷钾。土壤有效磷、速效钾平均含量有所提高，但土壤缺钾和缺磷的比例依然很高。因此，采用测土配方施肥技术，适当控制氮肥用量，有针对性地增施磷钾肥。(5)调整酸度。对于酸性土壤面积较大幅度增加状况，应合理调整用肥结构，适当多施钙镁磷肥、草木灰及石灰等碱性肥料，防止土壤进一步酸化。参考文献1边武英，董越勇浙江省标准农田水稻土有机质现状及改良措施J浙江农业科学2009(6)：104610492鲁如坤土壤农业化学分析方法M北京：中国农业科技出版社，20003ff_N桥，单英杰，ff-玉,磊，等浙江省标准农田地力调查与分等定级研究与应用J浙江农业学报，2011，23(2)：4
31、044084陈一定，单英杰，顾培，等浙江省标准农田地力与评价J土壤，2007，39(6)：987991万方数据噬菌体的应用与防治作者： 刘秀侠， 穆熙军， 孙学森， 张继晓， 迟文超， 王兰伟， 许燕侠， 谷巍作者单位： 山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院,山东泰安,271000刊名： 安徽农业科学英文刊名： Journal of Anhui Agricultural Sciences年，卷(期)： 2013(32)参考文献(28条)1.TWORT F W An investigation on the nature of ultra-microscopic viruses 1915(04
32、)2.D HERELLE M F On an invisible microbe antagonistic to dysentery bacilli 1917(03)3.刘明河 细菌病毒-噬菌体的应用概况 2002(04)4.江艳华;姚琳;王鹏 噬菌体及其裂解酶在食源性致病菌检测和控制中的作用 2011(10)5.CHO S;WHITTAM T S;BOXRUD D J Use of multiple-locus variable number tandem repeat analysis and phage typing forsubtyping of Salmonella Enteriti
33、dis from sporadic hum an cases in the United States 2010(03)6.SMITH G P Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface19857.ELLIS S E;NEWLANDS G F J;NISBET A J Phage-display library biopanning as a novel approach to identifyingnematode vaccine an
34、tigens 20128.CASTEL G;CHT(E)OUI M;HEYD B Phage display of combinatorial peptide libraries:application to antiviral research2011(05)9.WARD E S;GUSSOW D;GRIFFITHS A D Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domainssecreted from Escherichia coli 198910.KRISHNASWAMY S;KABIR
35、M E;MIYAMOTO M Cloning antifungal single chain fragment variable antibodies by phagedisplay and competitive panning elution 2009(01)11.邢佑尚;汪琳;赵胤泽 噬菌体抗体库及其在检验检疫中的应用 2012(05)12.BROVKO L Y;ANANY H;GRIFFITHS M W Bacteriophages for detection and control of bacterial pathogens in food andfood-processing e
36、nvironment 201213.姜琴;蒋鲁岩;黄克和 利用噬菌体快速鉴定沙门氏菌的研究 2007(06)14.刘心妍 噬菌体在食品安全中的应用和潜在风险 2011(06)15.钱震雯;岳启安;田凤丽 噬菌体治疗的研究概况 2007(16)16.栗艳 鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析 2013(10)17.SMITH H W;HUGGINS M B Effectiveness of phages in experimental E.coli diarrhea in calves,piglets and lambs 198318.BARROW P;LOVELL M;BERCHIERI A
37、 J Use of lytic bacteriophage for control of experimental Escherichia colisepticemia and meningitis in chickens and calves 1998(03)19.PARK SC;SHIMAMURA I;FUKUNAGA M Isolation of bacteriophages specific to a fish pathogen,pseudomonasplecoglossicida,as a Candidate for Disease Control 200020.CHANISHVIL
38、L N;CHANISHVILI T;TEDIASHVILI M Phages and their application against drug-resistant bacteria 200121.KUTTER E;DE VOS D;GVASALIA G Phage therapy in clinical practice:treatment of human infecfions 2010(01)22.景绍红;胡占云 抗生素替代物在养猪生产中的应用 2011(05)23.周德庆 微生物学教程 199324.YASIN T;MUSTAFA A A protein which masks ga
39、lactose receptor mediated phage susceptibility in Lacococmlaaissubsp 2002(02)25.GABS S;JOSEPHSEN J Improvement of phage defence in Laaococcus lactis by introduction of the plasmid encodedrestriction and modification system LIa AI 200326.MCGRATH S;VAN SINDEREN D;FITZGERALD G F Bactteiophage derived g
40、enetic tools for use inlactic acid bacteria200227.DOMINGUES S;CHOPIN A;EHRLICH S D The Lactococcal abortive phage infection system AbiP prevents both phage DNAreplication and temporal transcription switch 2004(03)28.SIURINO J M;KLAENHAMMER T R Expression of antisense RNA against Streptococcus thermophilus bacteriophages 2002引用本文格式：刘秀侠.穆熙军.孙学森.张继晓.迟文超.王兰伟.许燕侠.谷巍 噬菌体的应用与防治期刊论文-安徽农业科学2013(32)
