1、目的要求,1. 掌握微丝的染色方法。 2. 了解光镜下微丝的基本形态结构。,实验原理,真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架(cell skeleton)，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装结构的不同，可将细胞骨架分为微管(microtubule, MT)、微丝(microfilament, MF)和中间纤维(intermediate filament, IF)。微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。,当细胞用TritonX-100溶液处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮蓝（非特异性蛋白质染料）染色
2、后，胞质背景着色弱，微管等蛋白结构在光镜下无法分辨，在光镜下观察到主要是由微丝组成的应力纤维。应力纤维由平行排列的微丝组成，体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长。,微丝在细胞内的分布特征,实验用品,器具：CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸。 材料：盖玻片培养的成纤维细胞 试剂：6 mmol/L PBS（pH 6.5）、1TritonX-100溶液、M-缓冲液、3戊二醛固定液、0.2考马斯亮蓝染液、DMEM培养液。,实验步骤,1. 培养 在成纤维细胞进行传代培养时，将
3、已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培养皿中，于37、5%CO2的温箱中生长24h48h。 2. 染色处理 （1）取材 取出铺有细胞的盖玻片，放入小培养皿中（正面向上）,用PBS洗3次（从盖玻片一角轻轻滴加3 4滴），洗去表面的培养液。 （2）抽提 吸弃PBS，加入1% Triton X-100液4-5滴（刚好覆盖盖玻片表面），室温处理15min,（3）稳定 吸弃Triton X-100，立即用M-缓冲液轻轻地洗涤3次。（4）固定 略晾干，在3%戊二醛液中固定10min，再以 PBS液洗3次，洗去固定液。（5）染色 滴加3-5滴0.2%考马斯亮兰染液染色10 min，然后小心的用自来水漂洗。（6）观察 留取少量水分封片于载玻片，吸水纸吸去多余的水。光镜下观察临时装片。,实验结果,光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列。,光学显微镜下微丝分布图,注意事项,1. 洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去。 2操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面。 3染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤细胞。 4TritonX-100抽提蛋白时，注意避免抽提时间过长而导致细胞结构的破坏。,作业与思考题,1. TritonX-100液、M-缓冲液、戊二醛及考马斯亮蓝在本实验中所起作用？2微丝作图.,
