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类型2a 电泳.ppt

  • 上传人:yjrm16270
  • 文档编号:9211973
  • 上传时间:2019-07-29
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    2a 电泳.ppt
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    1、电泳,Electrophoresis,一、概述 二、电泳分类 三、凝胶电泳,2,1.电泳:带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳。迁移速率不同,可实现分离,一、概述,3,2.电泳的发展历史,1809年俄国物理学家Reuss首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。1937年瑞典Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius 电泳仪,用于人血清蛋白质混合液的分离。Tiselius 因在电泳技术方面做出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。,4,194

    2、8年Wieland 和Fischer 重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行研究。1959年Raymond 和Weintraub 利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。20世纪80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。,5,3.迁移率及其影响因素,3.1 迁移率:是指带电颗粒在单位电场下泳动的速度。3.2 迁移率的影响因素内因外因,6,3.2.1 影响迁移率的内在因素,所带静电荷的多少F=QE质量和形状空间阻力,7,质粒DNA的构象,8,3.2.

    3、2 影响迁移率的外界因素,电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 温度的影响 支持物的影响 电渗,9,电场强度,电场强度是指单位长度(每一厘米)支持物体上的电位降,它对泳动速度起着十分重要的作用。 当电压在500V以下,电场强度在 2-10v/cm 时为常压电泳。电压在 500V 以上,电场强度在20-200V/cm 时为高压电泳。 一般,电场强度越高,带电颗粒移动速度越快。,10,溶液的pH值,溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。 溶液的pH离等电点pl越远,质点所带净电荷越多,电泳迁移率越大。因此在电泳时,应根据样品性质,选择合适的pH值缓冲液。,11,溶液的

    4、离子强度,电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低,原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围,相成一个与运动粒子符号相反的离子氛(ionic atmosphere),它使该离子向相反的方向运动,从而降低了该粒子的迁移率。,12,温度的影响,电泳过程中由于通电产生焦耳热,热对电泳有很大的影响。温度每升高1,迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响,可控制电压或电流,或在电泳系统中安装冷却散热装置,13,支持物的影响(溶液介质),对支持物的要求一般是均匀和吸附力小,否则电场强度不均匀,影响区带的分离,实验结果及扫描图谱无法重复。,14,电渗,电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗

    5、(electro-osmosis)。其产生的原因是固体支持物多孔,且带有可解离的化学基团,因此常吸附溶液中的正离子或负离子,使溶液相对带负电或正电。应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。,15,二、电泳的分类,等电聚焦电泳 等速电泳 密度梯度电泳,电泳,自由电泳 (无支持体),区带电泳 (有支持体),滤纸电泳(常压及高压) 薄层电泳(薄膜及薄板) 凝胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶),16,凝胶电泳:由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持物的电泳。 特点: 1.可以制成非常均匀的凝胶,带电质点在凝胶的孔中泳动。 2.电泳操作方法简便,电泳速度快 3.分辨率高,重复

    6、性好,电泳图谱清晰。 4.适用于生化,免疫等定性定量测定,三、凝胶电泳,17,1 琼脂糖凝胶电泳,1.1 原理,琼脂糖凝胶电泳是分子生物学研究中常用的技术,可用于分离,鉴定和纯化DNA或RNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下,有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。,18,1.2 琼脂糖简介,天然琼脂(agar)是一种多聚糖,主要由琼脂糖(agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷,而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,由于这些基团带有电荷,在电场作用下能产生较强的电渗现象,加之硫酸

    7、根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此,目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,19,分离不同大小DNA片段的 合适琼脂糖凝胶浓度,20,1.3 电泳缓冲液,TAE:乙酸盐缓冲液 TBE:硼酸盐缓冲液 TPE:磷酸盐缓冲液,21,1.4 实验步骤,1. 制作胶模:用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住,并插入梳子,形成一个胶模并水平放置。,22,2.熔胶:按水平板的长宽0.5cm胶厚,量取0.5TBE,并按0.7的浓度称取agarose琼脂糖,在微波炉或电炉上加热至全熔。,23,3. 制备凝胶板 等凝胶温度降至大约5060以下时,加入1 mg/L溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5ug

    8、/mL ;摇匀并轻快地倒入水平板中,并除掉气泡。,24,在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭(EB)-ethidium bromide染色,此时,核酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。,溴化乙锭,25,4. 凝固后,将梳子轻轻拔出。去掉胶带,将水平板放入加有0.5TBE电泳缓冲液的电泳槽中,并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。,26,5. 点样,27,6. 电泳 盖好电泳槽盖子,选择适当的电泳电压(5V/cm)开始电泳。,28,7.当色素接近胶的先端,停止电泳,样品在紫外灯下观察、成像。,29,EB是强诱变剂,操作时应带手套,并注意安全。制备凝胶时,倒胶的温度不可太低,

    9、否则凝固不均匀;速度也不可太快,否则容易出现气泡。,1.5 常见注意事项,30,聚丙烯酰胺凝胶单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N,N四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)。,2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳,31,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性: (1)在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好; (2)化学性能稳定,与被分离物不起化学反应,在很多溶剂中不溶; (3)对pH和温

    10、度变化较稳定; (4)几乎无吸附和电渗作用,只要Acr纯度高,操作条件一致,则样品分离重复性好; (5)样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径; (7)分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,32,凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表: 分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质104 20-30 1-4104 15-201-5104-1105 10-15 110

    11、5 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6,33,按凝胶装置分为盘状电泳(图1)及板状电泳(图2)盘状电泳通常是不连续系统,利用缓冲液离子成分、pH、凝胶孔径进行电泳,带电颗粒电泳时具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。,聚丙烯酰胺凝胶电泳分类,34,图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3,35,图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板

    12、5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统,36,PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,37,不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。 电极缓冲液是pH8

    13、.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。,38,缓冲液离子成分、PH的不连续性:电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液,样品及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3,甘氨酸的电离小,有效迁移率小,称为慢离子;浓缩胶中的氯离子完全电离,有效迁移率大,称为快离子;蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后,氯离子跑得最快,留下一段低电导区,产生高电位梯度(电位与电导率成反比),使甘氨酸离子追赶氯离子,蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品

    14、层可以压缩0.25m的厚度。,浓缩效应,39,图4 电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序,3层胶中均有快离子,慢离子 B显示电泳开始后,蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。,40,图5 不连续系统浓缩效应示意图,41,分子筛效应:分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。 当样品进入分离胶,凝胶孔径变小,分子量小,阻力小,移动快;分子量大,阻力大,移动慢。电荷效应:电荷量不同,迁移率不同。,42,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等

    15、因素。 如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS),则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量,而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。,43,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE),SDS-PAGE电泳常见问题分析,1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响? 在SDSPAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是TrisHCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;

    16、而Cl离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。,44,2. 样品如何处理? 根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作

    17、用的还原SDS处理。 1)还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。 2)带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20的碘乙酸胺,并在室温保温30min。 3)非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1SDS

    18、沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。,45,3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用? 聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关; 制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择trisHCL系统,TEMED与AP:AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行;十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径? 聚丙烯酰胺的充

    19、分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。,46,5.“ 微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因? 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。 处理办法:待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因? 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙

    20、气泡未排除干净。 处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。 7. 为什么带出现拖尾现象? 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。,47,8. 为什么带出现纹理现象? 主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。 9. 什么是“鬼带”,如何处理? “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结

    21、合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用? 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。,48,11. 为什么电泳的条带很粗? 电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。 处理办法:适当增加浓缩胶的长度

    22、;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压; 12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢? 这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。 处理办法:电泳槽正确装配即可。 13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗? 这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。,49,50,14. 凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事? 通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色。 如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。 15. 电泳时间比正常要长? 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地pH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。,

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