1、G21研究报告G21生物技术通报B IO T E C H N O L O G Y B U L L E T IN2 0 0 8年增刊重组单抗药物的肽图分析魏敬双 程立均 刘进怀 贾茜华北制药集团新药研究开发有限责任公司 石家庄 0 5 0 0 1 5 摘 要G22 建立了重组单抗药物的肽图分析方法G22在变性条件下向抗体溶液加入还原剂G21打开抗体内部所有交联的二硫键G21再加入烷基化试剂封闭所有的自由巯基G21使抗体分子在溶液中以游离伸展肽链的形式存在G22加入胰蛋白酶G21将充分伸展的肽链酶解成小的肽段G22用反相高效液相色谱层析分析肽图谱G22对连续3批中试产品及理化测定对照品进行肽图分析
2、G21各样品均能酶解完全G21批间肽图谱一致G22该方法实用有效G21适于进行重组单抗等结构复杂的大分子蛋白药物的肽图检查分析G22关键词G22 重组单抗 肽图 抗狂犬病毒单抗 胰蛋白酶 反相H P L CP e p tid e m a p p in g o f r e c o m b in a n t m o n o c lo n a lA n tib o d y P h a r m a c e u tic a lsW e i Jin g sh u a n g C h e n g L iju n L iu Jin h u a i Jia O ia nN ew d ru g R 以0 . 1
3、% T F A的乙腈溶液为流动相B液O流速为1 m i /m in O梯度洗脱7 0 m in ( A液从9 5 %至3 0 % , B液从5 %至7 0 % ,检测波长2 1 4 n m O2 结果对连续3批中试规模制备的重组人源抗狂犬病毒单抗原液样品及理化测定对照品进行肽图分析,各批样品图形一致,结果见图2 O3 讨论生物工程产品的质量控制是保障产品质量的关键,其中肽图是研究蛋白质一级结构的一种重要的分析方法O对重组蛋白质药物来说,肽图分析可作为与天然产品或参考品作精密比较的手段,可以鉴别蛋白质的翻译后修饰,其次可以用作产品批间同一性的检测手段O早在1 9 9 2年, K ro o n 3
4、 等就通过肽图谱分析的手段,鉴别出了第一个获得F D A批准上市的治疗性单抗O K T 3的降解位点O目前,重组单抗药物已经成为生物技术制药的开发热点,我国也已有多个单抗产品获得生产批文O作为重组蛋白质药物质量控制的一项重要内容,关于单抗的肽图分析方法值得我们进行认真的实验摸索O对于含有多对二硫键的结构复杂的大分子蛋白质,为了得到酶解完全的肽段,首先需要将所有二硫键进行还原处理,使二硫键断裂成为还原状态的自由巯基O为防止自由巯基再次形成二硫键,可采用371万方数据生物技术通报B io te c h n o lo g y B u lle tin 2 0 0 8年增刊烷基化封闭的手段0通过上述处理
5、9蛋白质分子在溶液中成为彼此游离的伸展肽链9适于进行胰蛋白酶裂解0对于含有大量二硫键的蛋白质9溶液中必须有足够的还原剂才能使所有二硫键得到充分还原0关于所需还原剂和烷基化试剂的用量9M a y e s4 推荐的剂量是9 D T T的量比二硫键的总量多2 m M 9而碘乙酰胺的量则要比溶液中巯基的总摩尔数富余1 . 1倍0图2 重组人源抗狂犬病毒单抗原液样品及理化测定对照品的肽图471万方数据2 0 0 8年增刊魏敬双等 重组单抗药物的肽图分析为从重组单抗的肽图谱得到更多的信息 W a n等5 还曾尝试过先将重组抗体的轻链 重链分开 分别进行蛋白酶裂解之后进行R P -H P L C分析 利用这
6、种方法 鉴别出了一种单抗C G P 5 6 9 0 1的重链发生交联变异的情况 在对抗体样品进行变性及胰蛋白酶裂解前 均需将抗体样品的缓冲液置换为适于进行下一步操作的环境中 常规的换液方式是采用透析法 透析换液的过程非常耗时 一般需要透析几个小时 而且在透析过程中 常常伴随着样品的稀释 透析换液后样品浓度降低 本试验中 所有的换液操作通过超滤离心完成 使用超滤离心管 可以在很短的时间内完成换液操作 同时 样品还可以很方便地浓缩到所需要的浓度 所以 只要选择好合适的截流量 使用超滤离心管进行换液操作是代替透析法的非常实用的手段 鉴于台式高速离心机在一般的分析检测实验室已经属于常规仪器 所以用超滤
7、离心代替透析法并不需额外的仪器设备 却可以大大缩短实验的时间 同时也避免了频繁更换透析液的繁琐操作 除重组单抗药物外 其它一些分子量大 结构复杂 二硫键含量高的重组蛋白药物 如我公司在研的重组人血白蛋白 每分子含1 7对二硫键 的肽图谱分析都可以适用于本研究所建立的方法 参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典. 2 0 0 5年版3部 .北京 化学工业出版社 2 0 0 5 附录4 3 4 4 .2 Jo h n M W a ik e r. T h e P ro te in P ro to c o is H a n d b o o k . 2 n d e d itio n . H u
8、-m a n a P re ss 2 0 0 2 5 1 3 5 1 4 .3 K ro o n D J B a id w in - F e rro A L a ia n P . P h a rm a c e u tic a i R e se a rc h 1 9 9 2 9 1 1 1 3 8 6 1 3 9 3 .4 Jo h n M . W a ik e r. M e th o d s In M o ie c u ia r B io io g y v o iu m e 1 . H u m a n aP re ss 1 9 8 5 3 3 3 9 .5 W a n M S h ia u F
9、 Y G o rd o n W e t a i. B io te c h n o io g y a n d B io e n g in e e r-in g 1 9 9 9 6 2 4 4 8 5 4 8 8 .G24上接第1 7 1页G25选和检测更多中风相关多态性位点是我们研究的下一步目标2 0 将寡核苷酸芯片用于疾病与S N P的关联分析这个思路是可行的 芯片的高通量 平行性的特点 将会对多基因遗传病的分子病理机制的研究和易感基因的检测及个性化治疗起到较大的推动作用2 1 参考文献1 H a ssa n A M a rk u s H S . B ra in 2 0 0 0 1 2 3 1
10、 7 8 4 1 8 1 2 .2 R e y n a F a v is e t a i. H u m a n M u ta tio n 2 0 0 4 2 4 6 3 7 5 .3 C ie m e n s B T e m p fe r E v a -K a trin R ie n e r L u k a s A H e fie r e t a i.M e n o p a u se F e rtiiity A n d S te riiity 2 0 0 4 8 2 3 0 8 3 1 5 .4 李瑶主编.基因芯片技术-解码生命 北京 化学工业出版社 2 0 0 4 1 7 9 1 8 0 2
11、 0 1 2 0 3 .5 张晨 等.中华老年心血管病杂志 2 0 0 1 3 3 1 7 8 8 0 .6 B a rie y J M a rk u s H e t a i. J H u m H y p e rte n s 1 9 9 5 9 6 8 1 3 2 .7 C o u d e rc R M a h ie u x F e t a i. S tro k e 1 9 9 3 2 5 2 2 9 6 7 8 .8 F riso n i G B e t a i. JA M A 1 9 9 4 1 1 4 1 1 3 1 7 .9 苏净 谭兰.国外医学脑血管疾病分册 2 0 0 1 9 4
12、2 1 9 2 1 7 .1 0 L o p a c iu k S B y k o w sk a K K w ie c in sk i H e ta i. C iin A p p i T h ro m b H e -m o st 2 0 0 1 7 4 3 4 6 5 0 5 .1 1 张颖冬 等.中风与神经疾病杂志 2 0 0 1 1 8 4 1 9 8 2 0 0 .1 2 赵勇 等.中华老年心血管病杂志 2 0 0 1 3 4 2 4 7 9 2 .1 3 W iiso n A G e t a i. In fia m m a tio n 1 9 9 5 4 5 1 1 2 .1 4 N
13、a ssa r B A e t a i. A m H e a rt J 2 0 0 1 1 4 2 4 5 8 6 9 .1 5 T a n u s S a n to s JE D e sa i M F io c k h a rt D A . P h a rm a c o g e n e tic s 2 0 0 1 1 1 8 7 1 9 2 5 1 .1 6 G ra v e ste in L A B o rstJ . Im m u n o io g y 1 9 9 8 1 0 4 2 3 4 3 4 .1 7 C a rte r A M C a tto A J B a m fo rd JM
14、 G ra n t P J . A rte rio sc ie r T h ro m bV a sc B io i 1 9 9 7 1 7 5 8 9 9 4 .1 8 王先梅 等.国外医学脑血管疾病分册 2 0 0 1 9 3 1 5 4 6 .1 9 Jia o -Y u D e n g X ia n -E n Z h a n g Y u a n M a n g a Z h i-P in g Z h a n g . B io -se n so rs a n d B io e ie c tro n ic s 2 0 0 4 1 9 1 2 7 7 1 2 8 3 .2 0 K Y u n C
15、 C h a rie s G u M P ro v in c e C J X io n g D C R a o . G e n e ticE p id e m io io g y 2 0 0 4 2 7 2 0 9 2 1 1 .2 1 王忠 刘建勋 王永炎.中国药理学通报 2 0 0 2 1 8 6 6 0 5 8 .571万方数据重组单抗药物的肽图分析作者： 魏敬双， 程立均， 刘进怀， 贾茜， Wei Jingshuang， Cheng Lijun， Liu Jinhuai，Jia Qian作者单位： 华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄,050015刊名： 生物技术通报英文刊名
16、： BIOTECHNOLOGY BULLETIN年，卷(期)： 2008(z1)被引用次数： 1次参考文献(5条)1.国家药典委员会 中华人民共和国药典(3部) 20052.John M.Walker The Protein Protocols Handbook 20023.Kroon DJ;Baldwin-Ferro A;Lalan P 查看详情 1992(11)4.John M.Walker Methods In Molecular Biology 19855.Wan M;Shiau FY;Golxlon W Variant antibody identification by pepti
17、de mapping外文期刊 1999(04)本文读者也读过(10条)1. 魏敬双.程立均.贾茜.WEI Jing-shuang.CHENG Li-jun.JIA Qian 重组抗体的N-端氨基酸序列测定期刊论文-中国生物制品学杂志2008,21(12)2. 曾文珊.廖海明.杨仲元.徐康森.ZENG Wen-shan.LIAO Hai-ming.YANG Zhong-yuan.XU Kang-sen 肽图分析在重组人甲状旁腺素1-34产品质量控制中的应用期刊论文-中国药学杂志2006,41(13)3. 王菲.龙应国.胥照平 重组人尿型纤溶酶原激活剂中试产品的肽图分析期刊论文-军事医学科学院院刊
18、2000,24 (4)4. 魏敬双.陶苒.孙巍巍.贾茜.李川.梁米芳 抗甲肝病毒基因工程单抗分离纯化与鉴定期刊论文-生物工程学报2004,20(2)5. 黄震华.HUANG Zhen-hua 血小板糖蛋白b/a受体拮抗药依替巴肽期刊论文-中国新药与临床杂志2008,27(2)6. 龚士强.张静涛.刘燕.毛靖.周彬.GONG Shi-qiang.ZHANG Jing-tao.LIU Yan.MAO Jing.ZHOU Bin minTBP-PRGDN双靶向融合肽与金属钛表面作用稳定性的研究期刊论文-临床口腔医学杂志2010,26(3)7. 连继勤.戴旭芳.卢忠燕.王喆.甘立霞.何凤田.LIAN
19、Jiqin.DAI Xufang.LU Zhongyan.WANG Zhe.GAN Lixia.HEFengtian 人67 LR噬菌体结合肽的筛选与功能分析期刊论文-医学分子生物学杂志2008,5(6)8. 尹锐.郝飞.李芹阶.夏汝山.钟白玉.YIN Rui.HAO Fei.LI Qin-jie.XIA Ru-shan.ZHONG Bai-yu 穿膜肽对HPV16E7细胞毒性T细胞表位MHC-类抗原提呈影响的初步研究期刊论文-中华皮肤科杂志2007,40(11)9. 李丽琴.张守兰.杜秀宝 030 相思子毒素的放射免疫检测方法期刊论文-卫生毒理学杂志1999,13(3)10. 张旋.李健.李莉.王殿华.ZHANG Xuan.LI Jian.LI Li.WANG Dian-hua 肽转运载体与肽和仿肽类药物肺部转运期刊论文-昆明医学院学报2007,28(6)引证文献(1条)1.魏敬双.程立均.赵伟.周兴军.刘进怀.贾茜 重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的质控方法及质量标准的建立期刊论文-中国生物制品学杂志 2010(8)引用本文格式：魏敬双.程立均.刘进怀.贾茜.Wei Jingshuang.Cheng Lijun.Liu Jinhuai.Jia Qian 重组单抗药物的肽图分析期刊论文-生物技术通报 2008(z1)
