1、肿瘤分子生物学一、肿瘤细胞的物质代谢肿瘤细胞的最基本的生物学特征就是恶性增殖、分化不良、浸润和转移等。这些恶性行为与肿瘤的特殊生化代谢过程密切相关。细胞癌变是从致癌因素引起靶细胞的基因突变开始的，基因突变引起基因表达异常，导致细胞中蛋白质和酶谱及其功能的改变，酶是物质代谢的催化剂，当酶功能和活性发生重大变化时，必然引起物质代谢的改变。（一）糖代谢的改变肿瘤细胞糖代谢的改变主要表现为酵解明显增强。正常肝组织在有氧条件下由氧化供能约占 99%，而酵解供能仅占 1%，但肝癌组织中糖酵解供能可高达 50%。（二）核酸代谢的改变肿瘤组织中 RNA 及 DNA 合成速率皆比正常组织高，而分解速率则下降。（
2、三）蛋白质代谢的改变肿瘤相关的标志酶或蛋白，如胚胎性蛋白质合成速率增快。相反，与细胞分化相关的酶或蛋白合成则会减少或几乎消失。总之，与肿瘤细胞恶性增殖相关的生物化学代谢特点是：合成细胞结构成分的代谢途径明显增加；细胞成分及合成原料的分解代谢途径明显降低，酵解增加。二、肿瘤细胞酶学的改变肿瘤组织中某些酶活性增高，可能与生长旺盛有关；有些酶活性降低，可能与分化不良有关。例如肝癌病人在血中 -谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶的同功异构酶均可升高；骨肉瘤的碱性磷酸酶活性增强而酸性磷酸酶活性弱；前列腺癌的酸性磷酸酶可升高；肺鳞状细胞癌的脂酶活性随分化程度降低而减弱。由于癌细胞的新陈代谢与
3、化学组成都和正常细胞不同，可以出现新的抗原物质。有些恶性肿瘤组织细胞的抗原组成与胎儿时期相似，如原发性肝癌病人血清中出现的甲种胎儿球蛋白(AFP)，AFP 的特异性免疫检查测定方法是肝癌最有诊断价值的指标。结肠癌的血清癌胚抗原(CEA)；胃癌的胃液硫糖蛋白(FSA)、胃癌相关抗原(GCAA) 、2 糖蛋白(2GP)也可作为诊断参考。此外，绒毛膜上皮癌和恶性葡萄胎可检测到绒毛膜促性腺激素。蛋白激酶与细胞的增殖和分化有密切的关系，如 PKA、PKC 和 TPK 三种蛋白激酶活化后都可通过间接的机理促进蛋白质和 DNA 的合成，增强某些细胞基因如 c-myc/c-fos 的转录。但 PKA 的活性增
4、强常在细胞分化性增殖即良性增殖时发生，而去分化性增殖或恶性增殖时则往往伴有 PKC 和 TPK 活力的上升。在人类原发性肝癌中发现 PKC 在胞液和颗粒组分中分别是正常肝的 8.5 倍和 5.9 倍。三、肿瘤细胞膜的变化及其生化基础细胞癌变后肿瘤细胞膜上组分发生改变，较重要的是糖蛋白及糖脂结构的改变。常见大分子量糖蛋白消失及糖脂链缺损。糖链上唾液酸和岩藻糖的含量明显增多。这些改变与肿瘤的增殖、转移及免疫特性有密切关系。而质膜组成与结构的改变则导致对糖、氨基酸等营养物质的通透加快，接触抑制的丧失，细胞间粘着性减弱，细胞间交联和信息传递异常以及细胞表面特异受体和调控等机能的障碍等。 中国生物治疗网
5、 杨教授特别指出，这些变化反映在肿瘤的恶性行为上则表现为不受控制的增长、侵袭和转移。这些变化反映在肿瘤的恶性行为上则表现为不受控制的增长、侵袭和转移。（一）细胞通透性异常癌细胞膜的通透性表现异常，如癌细胞对某些糖类及氨基酸的运送比相应的正常细胞多，以致癌细胞能快速生长。（二）接触抑制降低或消失迅速生长的肿瘤细胞表面蛋白酶活性增强。由于蛋白酶可使细胞膜表面的糖蛋白水解，使带有糖链的多肽片段脱落下来，以至细胞不易粘着，接触抑制也消失，故蛋白酶可促细胞分裂，而蛋白酶抑制剂可抑制细胞分裂。（三）与植物凝集素起凝集反应植物凝集素使转化细胞发生凝集, 而相应的正常细胞在同样条件下则不凝集。与植物凝集素作
6、用的肿瘤细胞可显示出接触抑制现象。 （四）细胞膜粘着力降低癌细胞膜表面粘着力显著降低，其机械粘着力为正常上皮细胞的 1/5-1/3。因此癌细胞容易从原发部位脱离而发生侵袭和转移。四、肿瘤标志物和生化诊断（一）肿瘤标志物：是指那些与恶性肿瘤有关的能用生物学或免疫学方法进行定量测定的，并能在临床肿瘤学方面提供有关诊断、预后或治疗监测信息的一类物质。肿瘤标记物通常是由恶性肿瘤细胞所产生的抗原和生物活性物质，可在肿瘤组织、体液和排泄物中检出。（二）按肿瘤标志物的生化性质可分为以下几类1酶与同工酶类，如?一谷氨酰转肽酶、醛缩酶、乳酸脱氢酶；2蛋白质类：如癌胚抗原、甲胎蛋白等；3肿瘤代谢物：如多胺、儿茶酚
7、胺代谢产物；4激素：如人绒毛膜促性腺激素、降钙素等；5癌基因和抗癌基因类：如 p53 的点突变、Ras 基因的点突变。（三）肿瘤标志物在临床上应用主要在以下几个方面1原发肿瘤的发现；2肿瘤高危人群的筛选；3良性和恶性肿瘤的鉴别诊断；4肿瘤发展程度的判断；5肿瘤治疗效果的观察和评价；6肿瘤复发和预后预测。临床上诊断肿瘤，要求标志物有高的特异性和灵敏度，并且其含量与肿瘤的大小、进展程度呈正比。对于某一特定的肿瘤患者，可能应用几种特异性较高的标志物进行联合生化诊断，以提高诊断率和准确率。五、肿瘤发生的一般机制肿瘤是环境因素和遗传因素相互作用导致的一类疾病。大多数的环境致病因素如饮食、病毒、化学物质、
8、射线的致癌作用都是通过影响遗传基因起作用的。对结肠癌的研究证实，癌的发生发展是一个涉及多个基因的多阶段过程。在家族性结肠息肉（FPC）中抑癌基因APC 发生突变形成良性的腺瘤。随后， KRAS2 突变使其增生加速，DCC 发生缺失、TP53 缺失使其转变成恶性的结肠癌。最后，nm23H1 的缺失使其完成转移过程。六、 癌基因 癌基因或肿瘤基因是指能引起细胞恶性转化的基因, 也称转化基因。（一）病毒癌基因癌基因首先发现于病毒的基因组。研究发现一些病毒感染可使正常细胞恶变为癌细胞，细胞的恶性转化与病毒基因组中特定的基因相关。病毒癌基因不是野生型病毒基因组的成分，对病毒自身的生长、增殖并非必需。这种
9、病毒携带的转化基因就称为病毒癌基因。（二）原癌基因在一些动物和人的基因组中发现有病毒癌基因的同源序列，被称为原癌基因或细胞癌基因。解放军第 458 医院生物治疗中心杨博士 WWW.458SWZL.com 认为，细胞癌基因是人或动物细胞中固有的正常基因，参与调控细胞正常增殖、分化、凋亡及胚胎发育等重要的生物学功能，是维持细胞正常生命活动所必需的基因。病毒癌基因来源于细胞癌基因，是经过拼接、截短和/或重排后形成的融合基因。（三）原癌基因的激活原癌基因在机体生长发育过程完成之后，多处于封闭状态或仅有低度表达。当原癌基因的结构发生异常或表达失控时（原癌基因的激活） ，就会成为使细胞发生恶性转化能力的癌
10、基因。原癌基因可由以下几种方式被激活：1. 点突变：RAS 基因家族中经常发生点突变；2. 基因扩增：MYC、ERBB 基因家族在许多肿瘤中显示扩增；3. 染色体重排：如 85的Buriktt 淋巴瘤中发现有 t（8；14） （q24 ；q32）易位，使 c-myc 的表达受到 IgG 重链启动子的调控而过量表达；而慢性髓性白血病（CML）中的 t (9; 22)(q34; q11)易位（费城染色体） ，使 c-ABL 和 BCR 融合，编码有较高的酪氨酸激酶活性的融合蛋白。4. 启动子插入，如病毒ALV 插入到 MYC 的上游，其两端的 LTR 启动并增强了 c-MYC 的转录，从而诱导了淋
11、巴瘤的产生。一对细胞癌基因中只要有一个被激活，就可以以显性的方式发挥作用，使细胞趋于恶性转化。此外，不同癌基因在癌变过程中具有协同作用。（四）癌基因的分类和功能根据癌基因在细胞内相应的正常同源原癌基因蛋白产物的生物学功能和生化特性可将癌基因分为以下几类：1生长因子：生长因子可刺激细胞增殖，如 SIS 的产物为血小板生长因子(PDGF)?链，可促进间质细胞的有丝分裂；INT2 的产物为成纤维细胞生长因子 3（FGF3） ；HST 的产物为成纤维细胞生长因子 2（FGF2 ） 。2生长因子受体：生长因子受体与生长因子结合后形成蛋白质酪氨酸激酶，触发细胞的一系列反应。如 ERBB1 的产物为表皮生长
12、因子受体（EGFR） ；FMS 的产物为集落刺激因子受体（CSFR ） ；KIT 的产物为干细胞生长因子受体。3信号转导分子：本类细胞癌基因可分为两个亚类，一类是膜结合型的，其产物为蛋白质酪氨酸激酶，细胞癌基因 SRC、ABL、ROS 等均属此类。另外一类是胞质型的，其产物为蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶，位于胞质中，细胞癌基因 PIM、MOS、RAF 等属于此类。4转录因子：定位于核内，可调节某些基因转录和 DNA 复制，促进细胞的增殖，如细胞癌基因 MYC、JUN、FOS 等的产物。5细胞周期相关蛋白：Cyclin D、Cyclin E、CDK4 等。6. 细胞凋亡调节分子：Bcl-2。七、 抑
13、癌基因（一）抑癌基因及其生物学功能抑癌基因泛指由于其存在和表达，使机体不能形成肿瘤的那一类基因，也可称作肿瘤抑制基因。确定抑癌基因的三个必需条件：1）肿瘤相应的正常组织中此基因表达正常； 2）肿瘤中此基因功能失活或结构改变，或表达缺陷；3）将此基因的野生型导入此基因异常的肿瘤细胞内，可部分或全部逆转恶性表型。抑癌基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用，并能潜在地抑制肿瘤生长。点突变、缺失、启动子区 CpG 岛甲基化等变异使其功能丧失可导致细胞恶性转化而发生肿瘤。抑癌基因的变异通常是隐性的，只有两个等位基因的功能同时失活后才失去正常的抑癌功能。（二）重要的抑癌基因目前已知的
14、重要的抑癌基因有p53、Rb、p16 、BRCA1、BRCA2、APC、DCC、PTEN、VHL 等。其中，p53 是细胞周期中的负调节因子，与细胞周期的调控、DNA 修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关；Rb1 是细胞周期的转录调节因子； INK4a 编码的 p16INK4a 为 CDK 的抑制剂，而p19ARF 与 Mdm2 结合，稳定 p53；VHL 调节蛋白水解；DCC、E-Cadherin 为细胞粘附分子；APC 参与?-catenin、Wnt 信号通路的调节；MADR2、DPC4 调节传导 TGF?信号；PTEN 为双特异性磷酸酶；BRCA1 和 BRCA2 为转录调节因
15、子，参与 DNA 损伤修复；MSH2、MLH1 、 PMS1、PMS2、MSH6 参与错配修复。八、细胞周期与肿瘤（一）细胞周期的调节机制在细胞周期中起调节作用的重要蛋白包括：正向调节的细胞周期蛋白（Cyclins）和周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs） ；负向调节的 CDKs 抑制蛋白（CDK inhibitor，CKI） 。CDKs 的活性表达和调控是细胞周期调控的核心机制，它们各自在细胞周期内特定的时间激活，磷酸化相应的底物，驱动细胞周期各时相的进程。CDKs 的时相性激活主要依赖于 Cyclins 的细胞周期时相性表达、积累和分解。Cycli
16、n 与 CDKs 瞬时结合成活化的 Cyclin-CDKs 复合物，构成细胞周期的发动机。 安徽济民肿瘤医院 刘教授介绍，相应的 CDK 与 Cyclins 结合后，CDK 的激活与否还受到 CDK 激活性蛋白激酶（CAK） 、CDC25、CDK 抑制剂（CKIs） 、cyclin 降解等多重复杂机制的严格调控，如 CKIs 可与 Cyclin-CDK 复合物结合并抑制其活性，使细胞周期停止或减缓。人类细胞主要的 CDKs 有 CDK1（Cdc2） 、CDK2 、CDK4、CDK6；主要的周期蛋白有 cyclin B1、cyclin A、 cyclin E、cyclin D1、D2 和 D3
17、。CKIs 有两个主要的家族：一个是 Cip/Kip 家族，如 p21Cip1、p27Kip1 和 p57Kip2，主要与 CDK2 的抑制有关。另一个是 INK4 家族，包括p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d，它们主要与 CDK4 和 CDK6 的抑制密切相关。（二）细胞周期的启动机制细胞周期能否启动进行细胞增殖，主要的调控点在 G1 期，称为限制点（R 点） ，它决定细胞是否通过 G1 期进入 S 期。Cyclin D-CDK4/6 和 Cyclin E-CDK2 驱动细胞周期通过 R 点，对 G1/S 时相转换有限速作用。活化的 CDK4/6 和 CD
18、K2 作用于 pRb，使之磷酸化后释放转录因子 E2F，启动 DNA 复制，细胞进入 S 期。p15INK4b、p16INK4a、p18INK4c、p19INK4d、和 p21Cip1 可竞争结合 Cyclin D， p21Cip1 和p27Kip1 可竞争结合 Cyclin E，从而抑制 CDK4 和 CDK2 的活性，诱发 G1/S 期阻滞。（三）细胞周期的监控机制细胞中存在一套对细胞周期进行严密监视的监测机制，即细胞周期检测点机制，其功能是保证细胞复制的忠实性和基因组的完整性和稳定性。检测点功能丧失或异常将导致遗传不稳定性，并增加细胞癌变的可能。细胞周期内有两类检测点：时相次序检测点和
19、DNA损伤检测点。时相次序检测点可确保细胞周期时相的严格次序和不重复性。在 S 期检测点，Cyclin E 与 CDK2 结合，启动 DNA 复制。CDK2 和 Cyclin A 结合参与 G2 期的启动和进行。G2/M 检测点的核心是 Cdc2（编码 P34CDC2） ，激活后磷酸化在 M 期起关键作用的底物蛋白，使细胞进入 M 期。Cyclin B1 在 G2/M 转换点与 CDC2 形成 Cyclin B1/Cdc2（即有丝分裂促进因子 MPF） 。Cyclin B1/Cdc2 由 CAK（Cdc2 活化激酶，由 CDK7 和 Cyclin H 组成）磷酸化激活。P21CIP1 可能抑制
20、 Cyclin B1/Cdc2。有丝分裂中期到后期转换过程中存在纺锤体装配检验点，以防止染色体分离过程中发生错误。纺锤体装配检测点的成分包括 Mad1-3， Bub1/BubR1 和 Bub3。APC/C- Cdc20 复合物控制姊妹染色体的分离及 M 期 Cyclins 的降解。 在 DNA 损伤的情况下，哺乳细胞可将细胞周期阻止于细胞周期的相应时相。假如 DNA损伤不能被修复，细胞将进入凋亡程序。ARF-Mdm2-p53 途径在 DNA 损伤诱导的 G1 期阻滞过程中起重要作用。Cdc25 途径在 G2 期监测点中起重要作用， DNA 损伤使 Cdc25 失活，不能激活 Cdc2，实现 G
21、2 期阻滞。（四）细胞周期与肿瘤肿瘤细胞的最基本特征是细胞周期调控机制的破坏，导致细胞的失控性生长，因此肿瘤又被认为是细胞周期异常性疾病。细胞增殖失控和遗传不稳定性是肿瘤细胞最明显的特征，反映其检测点机制和 DNA 修复系统存在功能性缺陷。目前发现在人类肿瘤中，各细胞周期中的蛋白分子几乎都可出现不同程度的异常表达，它们或与癌基因和抑癌基因协同作用，或本身作为癌基因促进和维持转化。G1 期蛋白分子与细胞癌变的关系十分密切，例如 Cyclin D1 的过度表达，常见于大多数肿瘤。在不同的肿瘤细胞中，存在着不同的 Cyclins 和 CDKs 的过表达和基因的重排。CKIs（p21Cip1） 、Rb
22、 和p53 的异常是对细胞周期驱动机制的更为常见、更为直接的破坏。p16 最常见的异常是突变和缺失。九、细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，是细胞的生理性、主动性的“自杀行为“ 。细胞凋亡是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损细胞以保持机体内环境平衡和维持正常生理活动过程的一种自我调节机制。（一）细胞凋亡的一般特征胞浆空泡与胞膜融合导致膜发泡（blebbing） ；细胞皱缩、变圆，与临近细胞脱离；染色质凝聚、DNA 降解；胞质蛋白降解、线粒体功能丧失；核膜破裂，细胞核分解为碎片；胞膜内陷，将细胞内容物包被成囊状小泡，形成凋亡小体；凋亡小体被周围细胞吞噬，不引起炎症反应。
23、（二）细胞凋亡的主要信号通路1死亡受体途径：死亡受体属肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族，通过与相应配体结合，传递细胞凋亡的信号。被激活后可在几秒钟内级联活化 Caspase，也可通过激活线粒体凋亡信号，在几小时内完成细胞凋亡。研究得较多的有 Fas 和 TNFR。2线粒体途径：线粒体在接受凋亡信号后释放凋亡因子，包括细胞色素 C、Samc 和凋亡诱导因子（AIF）等。在细胞色素 C 和 ATP/dATP 存在下，细胞色素 C 和 Apaf-1 能通过其 N 端的 CARD 与 Caspase-9 结合，导致其自身剪切和活化，并进一步活化下游的Caspase，从而引发凋亡。（三）细胞凋亡调节分
24、子Caspase 家族、IAPs、死亡配体和受体、Bcl-2 家族、TRAIL/Apo2L 和 DR4、DR5 及诱饵受体、p53、MAPKs 家族、钙和 NO 信号等均可参与凋亡的调节。常见的促进凋亡的基因有Bax、Bak、Bad 、Bid、Bim、 Bcl-Xs、Noxa 等；抑制凋亡的基因有 Bcl2、Bcl-XL 、Bcl-W、Mcl-1 、ERK、Akt、IAPs 、 survivin、FLIP 、SODD 等。（四）常见的细胞凋亡检测方法电镜检测；细胞核的荧光染色，用 DAPI、Hoechest33258 等染料染色可显示细胞核固缩和断裂的情况；流式细胞术；磷脂酰丝氨酸（PS）标记
25、法，用荧光标记的 Annexin-V 可检测位于细胞膜内表面的 PS 外翻到细胞膜的外表面；DNA ladder；单细胞 DNA 电泳（彗星检测） ； DNA 缺口标记法，如 TUNEL 检测； Caspase 活性的检测；其它方法:如检测细胞的克隆形成率、线粒体细胞色素 C 的释放及其膜电位的降低等。（五）细胞凋亡与肿瘤癌症发生的重要原因之一是细胞凋亡异常。在恶性肿瘤的发病过程中，细胞凋亡异常的发生机制几乎涉及细胞凋亡信号途径的所有方面。以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的凋亡干预技术可能成为治疗恶性肿瘤的基本策略。目前大多数化疗药物都是通过诱导细胞凋亡清除肿瘤细胞。对细胞凋亡机制的深入研究可为抗癌药物的研发提供新的靶点和思路。许多细胞凋亡调节分子被用来作为抗肿瘤药物筛选及肿瘤基因治疗的的靶点。获得 FDA 批准的 Gleevec 已成功用于治疗 CML，是目前唯一能特异杀伤肿瘤细胞的小分子药物，其医药批发研发完全基于对细胞凋亡和信号转导的基础研究。同时，在肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因是肿瘤基因治疗的另一策略。例如腺病毒介导的 TRAIL 基因转移，不但能介导肿瘤细胞的凋亡，而且产生旁观者效应，同时对正常成纤维细胞和肺上皮细胞不起作用，但可大量杀伤肝细胞。而DR4 和 DR5 的单克隆抗体不仅呈现抗肿瘤活性，而且对肝脏细胞没有毒性，相关临床研究正在进行中。
