1、临床细菌学检验,芮勇宇南方医科大学 南方医院 检验科/检验系,医学博士、博士后，主任技师（正高）、副研究员，硕士导师，支部书记； 南方医院检验科临床微生物检验室主任； 南方医院检验系临床微生物学教研室主任； 办公室61642145，手机137 2985 2982，E mail: ,一、血液标本病原菌检验,目前我国社会老龄化日趋严重，慢性病及恶性肿瘤、器官移植、爱滋病和结核病病人不断增多，侵袭性诊疗技术广泛应用，败血症发病率不断增加。败血症病死率30%以上；早期病原学诊断和合理抗生素治疗，明显降低败血症病死率。,血液培养的送检指征：,发热38或低温10109/L，“核左移”白细胞增多； 粒细胞减
2、少，成熟的多核白细胞90次/分；呼吸频率20次/分； 二氧化碳分压32mmHg； 昏迷；多器官衰竭。,最好在抗生素使用前采集，若已用抗菌药须，则尽量避开血药浓度的高峰期； 建议第一次可在病人发热初期或高峰期采集，根据病人发热情况，在24h内再取2-3份标本，以提高病原菌检出率。,血液标本采集的注意事项：,标准血培养瓶（蓝色帽）： 帽子和标签纸左上方为蓝色， “Standard 10 Aerobic/F”， 用于成人需氧菌和真菌培养， 血液量3-10ml ，8-10ml最佳。,中和抗生素的树脂瓶（灰色帽）： 帽子和标签纸左上方为灰色， “PLUS+Aerobic/F” ， 血液量3-10ml ，
3、8-10ml最佳。,厌氧瓶（黄色或橘红色帽）： 帽子和标签纸左上方为黄色， “Standard Anaerobic/F”， 血液量3-7ml ，5-7ml最佳。,中和抗生素的儿童瓶（粉红色帽）： 帽子和标签纸左上方为粉红色， “PEDS PLUS/F”, 血液量1-3ml。,采集标本前先开申请单，到检验科细菌室或门诊领取血培养瓶； 采血前先在培养瓶标签纸左侧空白处（箭头所指处）填写抽血时间和病人科别、床号和姓名； 不要在培养瓶条形码上涂写，以免影响扫描。,将标签纸上条形码右侧部分（含数字）撕下贴于检查申请单上； 而其它标本均是将申请单上双联号码撕下贴于标本上。,注射器采血后，将血培养瓶帽子揭下
4、，橡皮由金属皮（围脖）固定于瓶上； 将橡皮塞用70%酒精消毒，注射器针头刺穿橡皮塞将血注入培养瓶内； 橡皮塞裸露即可。,细菌室接到已采集血液的培养瓶后，立即放入自动血液培养检测仪，自动培养及实时检测。,阳性初步结果报告： 仪器阳性报警，90%以上阳性标本24h内检出； 取出阳性瓶，对血液涂片及革兰氏染色； 立即将涂片结果（G+、G-细菌，球菌或杆菌，或真菌）电话通知相应科室，并在网上发出； 利用阳性血液进行K-B法药敏试验，第二天将初步药敏结果电话通知相应科室。,结果报告形式,血液涂片,血液涂片,血液涂片,血液涂片,血液涂片,血液涂片,阳性最终结果报告： 将阳性血液接种血平板培养细菌； 第二天
5、将血平板上生长的细菌鉴定及MIC法药敏试验；第三天发鉴定及MIC法药敏结果的正式报告。 阴性结果报告： 如培养5天仍为阴性，再接种血平板培养一天，核实为阴性后再发报告。,结果报告形式,二、中段尿标本病原菌检验,检测泌尿系统感染； 一般进行细菌和真菌培养、菌落计数和药敏； 也可离心后对沉渣进行涂片检查，革兰染色或抗酸染色； 也可用于淋球菌培养和涂片检查。,目的和意义,最常采集中段尿，晨起第一次尿送检最佳； 先用肥皂水、或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗女性外阴部及尿道口或男性尿道口，再用灭菌水清洗，最后用灭菌纱布檫拭；排尿弃去前段尿，留取中段尿约10ml于无菌容器内加盖送检。,采集方法,尿道病原菌
6、可在温暖尿液中繁殖，中段尿标本采集后应尽快送检，否则将影响病原菌计数的准确性； 排尿困难者可导尿，避免多次导尿所致尿路感染，导尿包必须为无菌的合格产品。,采集方法,不染色涂片 尿沉渣真菌,中段尿,中段尿,“培养出3种以上细菌，疑采集污染，重留标本”： 如培养出3种或以上细菌，且无优势菌；约10%的标本不合格，采集时污染，采集中段尿（尤其女性）最好由专门医护人员指导采集，以减少污染。,结果报告形式,“培养出少量某种细菌、菌落计数结果”： 如菌量较少 103ml，但为单一菌种，可能为采集时污染，也可能是真正的感染，临床医生可根据病人临床表现判断或再留取标本送检。,结果报告形式,“培养出某种细菌、菌
7、落计数结果、药敏结果”： 一般认为细菌或真菌105ml ，且必须有优势，才可以确定为感染，对优势菌进行鉴定和药敏。 104ml至105ml，也有意义。,结果报告形式,三、粪便标本病原菌检验,对肠道感染进行病原学诊断。 涂片革兰染色查细菌、球/杆菌比、真菌。 涂片暗视野查弧菌；抗酸染色。 培养沙门氏和志贺菌；培养弧菌；培养真菌； 菌群失调病人，对占优势细菌进行鉴定药敏。,标本采集： 挑取含脓、血或粘液粪便约2-3g； 置于清洁容器或置于保存液中送检； 排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子采集。,检查上下呼吸道感染 痰液（下呼吸道）和咽拭子（咽喉部）； 可进行涂片查细菌、真菌或抗酸杆菌； 可进行细菌、真
8、菌或结核杆菌培养； 上述检查只要一口痰即可，在一张检查申请单上选上述多个项目。,四和五、呼吸道标本的病原菌检验,采集深部痰，不是唾液和口水。 自然咳痰法，最好为清晨第一口痰，用清水反复漱口用力咳出第一口痰于无菌容器内； 支气管镜采集法。,采集方法,痰液,痰液,痰液,痰液,痰液,痰液,全球每年增加结核病人约800万1000万，死亡病人约300万；我国高发，广东也较高; 结核分枝杆菌菌体表面含脂质成分，不易着色，但一经着色后，在酸或乙醇的作用下也不容易脱色； 抗酸性菌呈红色，其它细菌及细胞等背景呈蓝色； 油镜下查遍整个涂片，或至少100个视野。,涂片抗酸染色：检查抗酸杆菌,1984年国内统一暂行规
9、定报告方式： 未找到抗酸杆菌； 找到抗酸杆菌1或2个，全视野发现1或2个； 找到抗酸杆菌 +，全视野发现3-9个； 找到抗酸杆菌 +，全视野发现10-99个； 找到抗酸杆菌 +，每视野发现1-9个； 找到抗酸杆菌 +，每视野发现10个以上。,涂片抗酸染色：检查抗酸杆菌,报“正常菌群”： 培养出的均为不致病的细菌； 培养出的细菌种类较多且无优势菌。报“无菌生长”：病人抗生素使用过度导致。,结果报告形式,报“分离出某种细菌或真菌，比例，药敏”： 分离出致病菌，而不是常见的正常菌群，且具有优势，约占血平板菌群总数的百分比%； 同一病人如痰中连续分离出同一种菌，3天内如果已经做过药敏试验，则不再做药敏
10、； 同一病人痰中细菌的种类和比例，会随着治疗情况变化，也受留取痰标本的质量影响。,结果报告形式,六、穿刺液（脑脊液）病原菌检验,脑脊液采集：通过腰椎穿刺术（Lumber puncture）以无菌操作采集脑脊液3-5ml于无菌小瓶或无菌试管中，一般第一管用于病原菌检验，第二管用于理化检验，第三管用于细胞学检验。,六、穿刺液（脑脊液）病原菌检验,引起脑膜炎的病原体脑膜炎奈瑟菌等抵抗力弱，不耐冷，故采集的脑脊液应立即保温送检或床边接种。 可查一般细菌真菌、隐球菌、抗酸杆菌。,新生隐球菌广泛分布于自然界，可存在人体体表、口腔及肠道； 经呼吸道侵入人体，由肺经血行播散时，可侵犯所有脏器组织，主要侵犯肺、
11、脑及脑膜； 好发于细胞免疫功能低下者，如AIDS、恶性肿瘤、糖尿病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者； 临床上怀疑隐球菌性脑膜炎时，常抽取脑脊液进行墨汁染色。,墨汁染色查隐球菌,脑脊液离心3500r/m，10分钟；弃上清，沉渣涂片； 墨汁染色时，先取一玻片，编号，先滴1滴印度墨汁，再将沉渣涂片，将适量墨汁和沉渣混匀，盖上盖玻片； 将显微镜视野调暗，先用低倍镜观察全片，再用高倍镜观察可疑的细胞； 必须找到典型形态的隐球菌，荚膜清楚，大小不一，有出芽等； 非致病性隐球菌无荚膜。,墨汁染色查隐球菌,墨汁染色 新型隐球菌,其它穿刺液：如胸腹水、关节腔液等，穿刺针注入无菌试管送检或将注射器直接送检； 如
12、为多管穿刺液或相关组织，请在申请单上注明是否都做培养鉴定； 采集注意事项：注意无菌操作；如培养出类白喉杆菌，常为采集时污染所致；可用血液培养瓶培养。,七、分泌物（伤口或脓液）病原菌检验,开放性化脓灶：应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用棉拭子蘸取或注射器吸取脓性分泌物。 瘘管内脓液：先用灭菌棉拭子挤压瘘管弃去前端脓液，再收集脓汁。,七、分泌物（伤口或脓液）病原菌检验,封闭性脓肿：可用注射器穿刺抽取。 疑为厌氧菌感染者：取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检；外界相通部位的标本，如痰不能作厌氧菌培养。,七、分泌物（生殖道）病原菌检验,性传播疾病，简称性病，是一组通过性行为传播的，
13、侵犯皮肤、性器官和全身多脏器损害的感染性疾病。 标本采集：常取生殖道分泌物，男性取尿道口分泌物或前列腺液，女性取外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物等。,G-双球菌,白带,淋病 涂片染色镜检： 急性淋菌性尿道炎敏感度和特异度高达90%以上；对慢性无症状淋病的女性患者涂片检查漏诊率达40%，故必须同时进行培养。 培养鉴定及药敏结果准确，诊断金标准。,解脲/人型支原体： 开展了培养鉴定及药敏试验； 需注意的是标本采集后应尽快送检。诊断试剂和方法要符合卫生部相关规定； 注意保护病人的隐私。,八、器械病原菌检验,静脉插管等标本：放入无菌试管中送检； 无菌试验：怀疑医疗用品被污染时送检； 空气培养
14、：到细菌室取培养平皿置于待测地点，打开平皿盖10min，盖上后送检； 医护人员手培养和物表培养：到细菌室取含消毒剂中和液的无菌试管，用棉签涂抹后放入试管中送检。,第一部分：标本分类、标本采集注意事项、涂片及鉴定结果解读；第二部分：药敏结果解读；第三部分：难鉴定细菌真菌分子鉴定新技术。,稀释法（dilution method）和K-B纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer disc agar diffusion method）； 稀释法的结果比K-B法的更准确。本实验室利用细菌自动鉴定和药敏仪，为稀释法药敏试验，由仪器自动判断药敏结果。,药敏检测的方法,根据临床实验室标准化委员会（clinica
15、l laboratory standards of institute, CLSI）标准判断 敏感（susceptible，S）：推荐使用； 中介（intermediate，I）：药物MIC接近体液或组织可达到药物浓度，但反应低于敏感株； 耐药（resistant，R）；指常规用药剂量不能达到MIC，临床疗效不可靠。,药敏检测的方法,抗菌药物的作用靶位,氨基糖甙类：阿米卡星Amikacin、庆大霉素Gentamicin 1代头孢：头孢唑啉Cefazolin 2代头孢：头孢呋辛钠Cefuroxime sodium 3代头孢：头孢他啶Ceftazidime、头孢噻肟Cefotaxime、头孢吡肟（
16、马斯平）Cefepime,细菌室药敏试验中常选用的抗生素种类,单环-内酰胺类：氨曲南Aztreonam 广谱青霉素类：氨苄西林Ampicilin、青霉素G Penicillin、苯唑西林Oxacillin 抗假单胞菌广谱青霉素：哌拉西林Piperacillin,复方-内酰胺类： 阿莫西林-克拉维酸（奥格门丁）Amoxicilin/clavelanate、 氨苄西林-舒巴坦（优力新）Ampicillin/Sulbactam、 哌拉西林-他唑巴坦（特治星）Pioeracillin/Tazobactam、 头孢哌酮-舒巴坦（舒普深）efoperazone/Sulbactam 碳青霉烯类：亚胺培南Im
17、ipenem、美罗培南Meropenem,多肽类：多粘菌素E Colistin E、替考拉宁Teicoplanin、万古霉素Vancomicin 磺胺类：复方新诺明（甲氧苄唑-磺胺甲唑）Timethoprim/Sulfamethoxazole 林可霉素类：克林霉素Clindamycin 大环内脂类：红霉素Erythromycin,氯霉素：氯霉素Chloramphenicol 三代喹诺酮：环丙沙星Ciprofloxaxin 、氧氟沙星Ofloxaxin 、左旋氧氟沙星Levofloxacin 、莫丙沙星Moxifloxacin 四环素类：四环素Tetracycline 利福平Rifampin,产
18、超广谱-内酰胺酶(extended spectrum-lactamase，ESBL)：该酶水解青霉素、头孢菌素及单胺类的超广谱-酶，主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生；CLSI规定， ESBL确认试验（+） ：则对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南均应报告耐药，而不考虑体外药敏结果，建议用碳青霉烯类抗生素。,耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistance staphylococcus，MRS），CLSI规定，葡萄球菌如对苯唑西林（或甲氧西林）耐药：对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和含酶抑制剂的复方制剂均应报告耐药，而不考虑体外药敏结果。,耐高浓度庆大霉素肠球菌（Hi
19、gh level aminoglycosides resistance in Enterococcus）CLSI规定，肠球菌引起的全身性严重感染，常联合应用-内酰胺类和氨基糖肽类抗生素，如果肠球菌对高浓度庆大霉素耐药，则联合用药无效。,3、临床分离菌株的分布和药敏分析,利用WHO提供的WHONET软件，建立细菌耐药监测数据库。 可以对不同时期、不同科室、不同属种、不同类型标本等的资料分别进行分析。 下面介绍本院09年细菌耐药资料分析结果。,第一部分：标本分类、标本采集注意事项、涂片及鉴定结果解读；第二部分：药敏结果解读；第三部分：难鉴定细菌真菌分子鉴定新技术。,临床常见细菌鉴定要点,临床常见细
20、菌鉴定要点,G+球菌,G-球菌,G-杆菌,G+杆菌,氧化酶，O/F 肠杆菌科 非发酵菌,分枝杆菌,菌落特征、革兰/抗酸染色,触酶 葡萄球菌+ 肠球菌- 链球菌-,触酶，氧化酶 奈瑟菌+ 布兰汉菌+,4糖：葡乳麦蔗 DNA， N硝还,临床常见G+球菌鉴定要点,葡萄球菌,链球菌,肠球菌,触酶+,触酶,触酶,金葡 溶血 凝固酶+,溶血葡 溶血 凝固酶-,表皮葡 不溶血 凝固酶-,肺炎链 溶血 奥扑托辛S,化脓链 溶血 杆菌肽S,无乳链 溶血 CAMP+,高盐 七叶苷 阿拉伯糖,屎肠 阿+,粪肠 阿-,发酵菌 氧化/发酵，+/+ 肠杆菌科,例外：非发酵菌 氧化/发酵，+/- 不动杆菌：G-球杆菌； 嗜
21、麦芽寡养单胞菌：菌落黄色。,例外：发酵菌 氧化/发酵，+/+ 弧菌属,非发酵菌 氧化/发酵，+/- 假单胞菌属,氧化酶-,氧化酶+,临床常见G-杆菌鉴定要点,O/F，KIA 肠杆菌科生化,O/F 非发酵菌生化,血清学鉴定,O157：H7、沙门菌属、志贺菌属 血清学鉴定,临床分离细菌真菌中，有少部分通过传统生化反应和表型方法难以鉴定，给临床诊断和治疗带来困难。 目前细菌真菌核糖体基因序列分析，已经成为分类的金标准。 随着分子生物学技术的飞速发展，根据细菌和真菌基因组的特点，对它们的核糖体基因进行扩增并测序，可以准确阐明难鉴定病原菌的属种。,细菌的16S rRNA编码基因由保守区和可变区组成，保守
22、区为细菌共有，细菌间无差别,可变区具有属种差异。 真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因由保守区和可变区组成，它们之间的ITS2区域也有属种差异。,本研究利用通用引物扩增分别扩增细菌的16S rRNA基因和真菌核糖体的转录间隔区2（ITS2）， 对PCR产物进行测序，将序列结果在GenBank进行Blastn比对。 具体方法略，相关研究即将发表。,本研究从血液中检出2例临床不常见细菌。 1例是生痰二氧化碳嗜纤维菌，G-球菌，是人类口腔的正常菌群，属于条件致病菌，常通过口腔粘膜进入血液，感染者大多患有血液系统恶性肿瘤或粒细胞减少等疾病。该例患者岁，男性，诊断为地中海贫血，来自小儿科层
23、流病房。,另外1例是根癌农杆菌，G-杆菌，普遍存在于土壤，生活在植物根的表面，依靠由根组织渗透出来的营养物质生存，能诱发植物产生肿瘤，一般应用于植物的转基因研究。该例患者20岁，女性，诊断为急性胰腺炎，来自消化内科。 上述2例细菌引起的败血症国内文献未见报道，国外有4例病例报道。,本研究检出4例临床难鉴定真菌。 第1例是马尔尼菲青霉菌，常感染艾滋病患者，本病多见于东南亚。该例患者39岁，男性，艾滋病抗体阳性，以肺炎收治于感染科。,第2例是Arxiozyma telluris，属于产孢子酵母菌，首次从南非土壤分离得到，大都感染啮齿类动物和鸟类，较少感染人、猪、牛。此例标本来源是痰液，与白色念珠菌混合感染。该例患者82岁，女性，以肺部感染收治于呼吸内科。,第3例是黑曲霉菌，标本来源是患者耳部脓液。该例患者25岁，女性，就诊于耳鼻喉门诊，诊断为慢性化脓性中耳炎，国内文献报道耳部真菌感染的主要病是黑曲霉菌。,第4例是镰孢菌，标本来源是眼部分泌物。该例患者48岁，女性，诊断为角膜炎，来自眼科。我国镰孢菌所引起的真菌性角膜炎占真菌性角膜炎体的近40。,Thank you!,
