1、第十一章 临床免疫检验仪器,学习要求,掌握临床免疫检验常用仪器的特点;熟悉临床免疫检验常用仪器的分析原理;了解临床免疫检验常用仪器的使用与维护。,主 要 内 容,酶免疫分析仪,发光免疫分析仪,放射免疫分仪析仪,免疫浊度分析仪,时间分辨荧光免疫分析仪,第 一 节 酶免疫分析仪,一、酶免疫技术的分类二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及结构三、酶免疫分析仪的性能评价及维护保养四、酶免疫分析仪的临床应用,根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为:酶扩大免疫测定非均相酶免疫测定 克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫法均相酶免疫测定固相酶免疫法 (ELISA）,一、酶免疫技术的分类,基本概念,二、酶免疫分析仪
2、的类型、工作原理及基本结构,酶标仪一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能，还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作步骤繁琐。全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、孵育、震荡、洗板和酶标仪功能于一体。,（一）酶免疫分析仪的类型-1,微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪) 半自动微孔板ELISA分析仪 全自动微孔板ELISA分析仪 管式固相酶免疫测定仪器 小珠固相酶免疫测定仪器 磁微粒固相酶免疫测定仪器等,（一）酶免疫分析仪的类型-2,1.微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪)有单通道和多通道两种类型工作原理与主要结构和光电比色计相同和不同之处在于：比色液的容器是塑料微孔板以垂直光束通过待测液,酶标仪的工作原理
3、图,2.自动化酶免疫分析系统,在酶标仪的基础上再加上配置:加样系统温育系统洗板系统判读系统 机械臂系统液路动力系统软件控制系统,系统优势-1,自动化程度高： 前后处理一体化设计，减少人与样品的接触机会，降低污染。能进行各种自动安全检测。 稳 定：只要避免人为操作错误，可连续数 年良好工作。 准 确：不存在交叉污染，确保结果准确。,系统优势-2,高 速：加注、读板速度快 扩展性：软件可升级，样本量增加，可联 机使用 用户做主更多：开放式试剂；WINDOW操作系统；中/英/日自选操作界面；自定义编程；自动/自定义时间表；无限存档。,三、酶免疫分析仪的性能评价及维护保养,（一）性能评价,1滤光片波长
4、精度检查及其峰值测定； 2灵敏度和准确度； 3通道差与孔间差检测； 4零点漂移； 5精密度评价； 6线性测定； 7双波长评价；,三、酶免疫分析仪的性能评价及维护保养,（二）维护保养,重点：光学部分1滤光片波长精度检查 2通道差与孔间差检测,四、酶免疫分析仪的临床应用,.病原体及其抗体的检测2.各种免疫球蛋白和细胞因子、补体3.肿瘤标志物4.多种激素5.药物和毒品等。,第二节 发光免疫分析仪,将发光反应与免疫反应相结合的免疫分析方法 采用微量倍增技术，敏感性度，特异性好，所用试剂安全、稳定； 检测范围广泛，从传统的蛋白、激素、酶乃至药物均可检测 发展迅速，各种仪器不断出现，自动化程度越来越高。,
5、一、发光免疫的分类-1,酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统黄嘌呤氧化酶系统 非酶促化学发光：吖啶酯系统草酸酯系统三价铁-鲁米诺系统,闪光（Flash）发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样(In Situ Injector) 和时间积分法测量 辉光（Glow）发光时间在数十分钟以上，如： -HRP-Luminol系统-AP-AMPPD系统-黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样、 以速率法测量。,按发光持续时间,一.发光免疫的分类-2,时间,发光信号,辉光坪区,速率法测量,原位进样,积分法测量,闪光尖峰,闪光-辉光测量方式差别,消除放射性危害 无半衰期限制，试剂稳定性、有效期延长 实现连续、动
6、态、重复测定,优越性-1,闪光-辉光测量方式差别,适合于复合标记系统多指标测定 操作简单，反应快，易实现自动化 灵敏度和线性范围超过以往技术,优越性-2,闪光-辉光测量方式差别,三.发光免疫技术分类,根据示踪物检测的不同而分为：荧光免疫测定电化学发光免疫测定化学发光免疫-再根据标记物的不同又分：-化学发光免疫分析-微粒子化学发光免疫分析-电化学发光免疫分析-化学发光酶免疫分析-生物发光免疫分析临床以前三者较为常用。,三.发光免疫分析的基本测定方法,根据发光反应检测方式的不同可分为1液相法 反应在液相中进行，经离心或分离措施后，再进行测定发光强度2固相法 将抗原抗体复合物结合在固相载体(如聚苯乙
7、烯管)或分离介质上(如磁性微粒球等)，再进行测定发光强度 3均相法 同均相酶免疫法，不需要经过离心或分离步骤，即可直接进行发光强度检测,夹心法特点,分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。 功能灵敏度：测定误差（变异）20%的最低可检测浓度。 线性范围：功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度。 相关系数：0.99的曲线范围。,四、发光免疫分析仪的种类、工作原理和基本结构,(一)全自动化学发光免疫分析系统采用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合的免疫分析系统,(一)全自动化学发光免疫分析系统,1仪器测定原理,该类分析技术有两种方法： -竞争法 测定小分子抗
8、原物质 -夹心法 测定大分子抗原物质,竞争法特点,分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值。 功能灵敏度：（变异）20%的最低可检测浓度。 线性范围：功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度。 相关系数：0.99的曲线范围。,(一)全自动化学发光免疫分析系统,一般由主机和微机两部分组成： （1）主机部分：包括原材料配备部分：反应杯、样品盘、试剂盘、纯净水、清洗液、废水在机器上的贮存和处理装置。液路部分：过滤器、密封圈、真空泵、管道、样 品及试剂探针。机械传动部分：传感器、运输轨道。光路检测部分：光电倍增管和线路控制板。,2仪器组成,全自动化学发光 免疫分析系统
9、,66,IMMUNOLOGY,(一)全自动化学发光免疫分析系统,2仪器组成,（2）微机系统程控操作指示判定数据处理故障诊断自动监视,（二)全自动微粒子化学发光免疫分析系统,采用微粒子化学发光技术对人体内的微量物质以及药物浓度进行定量测定具有高度的特异性、高度的敏感性和高度的稳定性等特点,（二)全自动微粒子化学发光免疫分析系统,1.分析方法采用磁性微粒作为固相载体，以碱性磷酸酶作为发光剂，扩大测定的范围。以免疫测定方法为基础： -竞争法-夹心法-抗体检测等,（二)全自动微粒子化学发光免疫分析系统,2.分析过程抗原抗体结合； 加入碱性磷酸酶标记的抗体；形成固相包被复合物；在电磁场中进行23次洗涤分
10、离； 加入底物；通过光量子阅读系统记录发光强度；在标准曲线上计算出待测抗原的浓度。,（二)全自动微粒子化学发光免疫分析系统,3.仪器组成微电脑控制样品处理系统实验运行系统中心供给和控制系统,(三)全自动电化学发光免疫分析仪,电化学发光免疫分析技术在新一代实验室免疫检测技术中很有特点，它在20世纪如年代一问世就引起广泛的关注 德国公司在链酶亲和素生物素包被技术基础上，引用电化学发光免疫分析技术并开发出相应的全自动电化学发光免疫检测系统,1.测定原理及过程,待测标本与包被了抗体的顺磁性微粒和发光剂标记的抗体共同温育（形成磁性微珠包被抗体抗原发光剂标记抗体复合物）吸人流动室，缓冲液冲洗磁性微粒流经电
11、极表面时，被电极下的磁铁吸引，而游离的发光剂标记抗体被冲洗走同时在电极加电压，启动电化学发光反应，使发光试剂标记物三氯联吡啶钉Ru(bpy)32+TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光 光的强度与待测抗原的浓度成正比,(三)全自动电化学发光免疫分析仪,(三)全自动电化学发光免疫分析仪,2.仪器组成及特点,由样品盘、试剂盒、温育反应盘、电化学检测系统及计算机控制系统组成 应用三种抗原抗体反应方法：-抑制免疫法 检测小分子量蛋白抗原-夹心免疫法 检测大分子量物质-桥联免疫法 检测抗体如IgG、IgM另：钉标记用于DNARNA探针分析,（四）发光免疫分析仪的临床应用,主要应用于以下几方面检测：
12、 1甲状腺系统 2性腺系统 3血液系统 4肿瘤标记物 5心血管系统 6血药浓度 7感染性疾病 8其他检测 （Ig、血清皮质醇、尿皮质醇、尿游离脱氧吡啶等）,第三节 放射免疫分析仪（radio immunoassay ,RIA）,放射性核素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的高特异性结合 放射免疫技术主要包括：-放射免疫分析(radio immunoassay, RIA)-免疫放射分析或免疫放射度量分析 ( immunoradiometric assay，IRMA),一、 放射性核素的种类特点和检测仪的基本结构,（一）放射性核素的种类和特点,放射性核素依衰变方式分、三种，用于放射性标记的有和两类;分别
13、用液体闪烁及计数器测定。目前常用的是型放射性核素，如125I、131I、57Cr和60Co，以125I最常用；型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用,一、 放射性核素的种类特点和检测仪的基本结构,（二）检测的基本结构及其探测原理将射线（放射能）与闪烁体的作用转换成光脉冲（光能），然后用光电倍增管将光脉冲转换成电脉冲（电能）。电脉冲在单位时间内出现的次数（即仪器记录的cmp值）反映了发出射线的频率电脉冲的电压幅度则反映了射线能量的高低。,二、晶体闪烁计数器组成和工作原理,（一）仪器组成及工作原理1闪烁体2光电倍增管（1）光阴极 （2）打拿极 （3）阳极 3多道脉冲分析器,二、晶体闪烁计
14、数器组成和工作原理,多道分析器（MCA）是进行能谱分析的重要仪器。现代的MCA与通用微型计算机有许多共同特性，是现代核探测分析及放射影像装置的重要组成部分。,二、晶体闪烁计数器组成和工作原理,（二）-辐射计数器,整机可分为：采样部分-探头、换样装置、高低压电源、放大器及单道组成数据处理部分-接口、计算机、输入输出装置,三.放射免疫分析仪的应用,常用于测定：激素微量蛋白质 肿瘤标志物药物,第四节 免疫比浊分析仪,现在临床上测定微量蛋白(如Ig等) 已发展到现代自动免疫分析技术，其灵敏度逐步提高，检测水平由微克到纳克，甚至皮克水平。微量蛋白免疫分析随着自动化程度不断提高，在临床上得到广泛应用，其自
15、动化检测方法主要为免疫比浊法,免疫比浊法 免疫透射浊度测定法 免疫透射比浊法 免疫胶乳浊度测定法终点散射比浊法 免疫散射比浊法速率散射比浊法,第四节 免疫比浊分析仪,光路示意图如下：,第四节 免疫比浊分析仪,第四节 免疫比浊分析仪,免疫分析比浊技术的主要优势 (1)稳定性好，敏感性高 (2)分析简便、快速 (3)避免标本之间及标本对人的污染 (4)标本用量少,一、 免疫比浊测定的基本原理,（一）免疫透射比浊测定免疫透射比浊度测定(turbidimetry) 免疫透射比浊测定免疫胶乳浊度测定 光路示意见下图 ：,（一）免疫透射比浊测定,1.免疫透射比浊测定原理抗原抗体在缓冲液中快速形成抗原抗体复
16、合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过剩时，形成的复合物随抗原增加而增加，反应液的浊度亦随之增加。,（一）免疫透射比浊测定,2.免疫胶乳浊度测定法原理选择均匀一致的胶乳颗粒吸附抗体，当遇到相应抗原时，发生凝集；单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝集时，则使透过光减少，减少的程度与胶乳凝聚成正比。,（二）激光散射浊度测定,激光散射浊度测定(nephelometry)分为：-终点散射比浊法(end nephelometry)-速率散射比浊法(rate nephelometry),（二）激光散射浊度测定,基本原理：激光散射光系沿水平轴照射，碰到抗原抗体复合物时，导致光线被
17、折射，发生偏转0o 90 o，其偏转角度因光线波长、离子大小不同而有所区别。散射光的强度与抗原-抗体复合物的含量成正比，和散射夹角成正比，和波长成反比 。,（二）激光散射浊度测定,基本原理：,（二）激光散射浊度测定,1.终点散射比浊法抗原抗体反应达到平衡时（通常为3060分钟），复合物浊度不再受时间的影响，在聚合产生絮状沉淀之前进行浊度测定。散射比浊法是测定抗原与抗体结合完成后测定其复合物的量。,（二）激光散射浊度测定,2.速率散射比浊法速率是指抗原抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率散射比浊法是在抗原与抗体反应的最高峰(约在1分钟内)测定其复合物形成的量，该法具有快速、准确的
18、特点。,（二）激光散射浊度测定,3.激光散射浊度测定仪 (1) ARRAY特种蛋白分析测定系统 由微电脑控制，可以定量检测体液中微量蛋白的全自动组合仪器。,仪器主要部件 （1）散射测浊仪 光源采用双光源碘化硅晶灯泡(400-620nm)； （2）加液系统 具有液体感知装置，控制加液体积的准确性； （3）试剂和样品盘 （4）阅读器 读取卡片内贮存的参数。,（二）激光散射浊度测定,（二）激光散射浊度测定,仪器主要特点： IC悬浮颗粒所产生的散射光速率变化强弱与抗原浓度成正比；速率峰值经微电脑处理转换成抗原浓度；测到所需的速率峰值后，仪器通过峰值鉴定程序再对此峰值进行确证；抗原过剩的监测 在抗原过剩
19、的情况下，仪器重新对标本进行稀释，然后再次测定；使用抗体、标准血清、抗体卡片和校正卡片。,（二）DBl00特种蛋白分析测定系统,DB 100特种蛋白分析测定系统，由分析仪、计算机打印机、条码读取器四部分组成。分析仪是该系统的主要部分，包括： （1）散射测浊仪 光源采用发光二极管 （2）加液系统 （3）支架运输装置 （4）比色杯装置,（二）DBl00特种蛋白分析测定系统,仪器主要特点： 固定时间测定：利用两个时间光散射检测之间的差异，在免疫反应混合物预备10秒钟测定第一次光散射的值t1)，然后在反应6分钟后测定第二次光散射的值(t2)终点检测法：检测预温30分钟后光散射的值(t1)。通过终点光散
20、射强度与贮存在计算机内校准曲线进行比较，即可得出该物质的浓度。,三、免疫比浊分析的临床应用,1免疫功能监测； 2心血管疾病检测； 3炎症状况监测； 4类风湿性关节炎的检测； 5肾脏功能监测； 6营养状态监测； 7新生儿体检； 8凝血及出血性疾病的检测； 9贫血监测； 10血脑屏障监测。,时间分辨荧光免疫测定基本原理是以镧系元素铕（Eu）螯合物作荧光标记物，利用这类荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。,第五节 时间分辨荧光免疫分析仪（timeresolvedfluore
21、scenceimmunoassay，TR-FIA）,测定原理,第五节 时间分辨荧光免疫分析仪,第五节 时间分辨荧光免疫分析仪,Ab*+AgAb*Ag+Ab 抗原抗体反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离， 然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量， 从而推算出标本中的Ag量， 该方法称为非均相荧光免疫测定法。,基本反应式如下：,一、时间分辨荧光免疫检测原理,用镧系三价稀土离子及其螯合物作为示踪物标记抗原、抗体、核酸探针等物质,一、时间分辨荧光免疫检测原理,当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光，测定免疫反应最后产物的特异性荧光信号。,一、时间分辨荧光免疫检测原理,二、时间分辨荧光免疫分析的特点,特异性强 灵敏度高 标记物稳定 线性范围更宽，重复性更好 检测动态范围宽，可达45个数量级 标记物制备简单，稳定性好，使用时间长,三、时间分辨荧光免疫分析的应用,（一）蛋白质和多肽激素分析 （二）半抗原分析： （三）病原体抗原/抗体分析 （四）肿瘤标志物分析 （五）干血斑样品分析 （六）核酸分析 （七）测定天然杀伤细胞的活力,再见！,
