1、2009-11-03,1,炔孕酮的含量测定：精密称取炔孕酮0.1g，加无水乙醇溶解并定量转移至100ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置另一100ml的量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀(成每1ml含10g的溶液)。照分光光度法，在240nm波长处测定吸收度为0.51。按C21H28O2的吸收系数(E1%1cm)为520，计算炔孕酮的含量。(98.08%),A=0.51,g/100ml,2009-11-03,2,第十一章 抗生素类药物分析,2009-11-03,3,在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。,第一节 概述,是某些微生物例如细菌、放线
2、菌、真菌等的代谢产物或合成的类似物，小剂量时对各种病原微生物有强力的杀灭或抑制作用，而对宿主不会产生严重的毒性。临床上多数抗生素用于治疗细菌感染性疾病。某些抗生素还可抗肿瘤，有些具有免疫抑制(环孢素、雷帕霉素、霉酚酸，为器官移植抗排斥和自身免疫性疾病药物)和刺激植物生长(赤霉素、多氧霉素)的作用。 应用于医疗、农业、畜牧和食品工业。,抗生素,2009-11-03,4,经化学纯化、精制、化学修饰等过程，最后制成适当制剂。其结构和组成比一般的化学合成药物更为复杂。,一、抗生素药物的主要来源及特点,抗生素的来源,化学全合成和半合成方法,生物合成(微生物发酵),少数,绝大多数,2009-11-03,5
3、,特点： 化学纯度较低。原因：同系物多，异构体多，降解物多。 活性组分易发生变异：生物合成时，微生物菌株的变化、发酵条件改变等均可导致产品质量发生变化，如组成或比例发生改变。 稳定性差：抗生素分子结构中含有的活泼基团会发生变化，导致抗生素稳定性变差。,庆大霉素是庆大霉素C的复合物(C1,C2,C1a, C2a)，也有极少量庆大霉素A、B、X等,很多抗生素具有旋光性，如果用合成的方法得到，产物中不可避免会有异构体存在；四环素类在水溶液中会发生差向异构化，产生异构体。,降解物多是与抗生素的不稳定性有关，会降解产生一些降解产物。,如：-内酰胺类抗生素的-内酰胺环是结构活性中心，性质活泼，是分子结构中
4、最不稳定的部分，降解后会失去抗菌活性。,2009-11-03,6,分类依据,来源 作用对象细菌(革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌)、真菌。为临床选用抗生素带来一定方便 作用机制干扰细菌细胞壁的合成；影响细菌蛋白质的合成；与细胞膜相互作用；抑制核酸的转录和复制 生物合成途径 化学结构有利于抗生素工业生产和质量分析研究,二、抗生素类药物的分类：,常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等； 常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等,2009-11-03,7,内酰胺类 (青霉素类，头孢菌素类) 氨基
5、糖苷类 (链霉素，庆大霉素，卡那霉素等) 四环素类 (四环素，土霉素等) 大环内酯类 (红霉素，麦迪霉素，螺旋霉素等) 多烯大环类 (两性霉素B等) 多肽类 (放线菌素等) 苯烃胺类 (氯霉素等) 蒽环类 (阿霉素等) 其他 (不属于上述类型的抗生素),化学结构,影响细菌蛋白质的合成,干扰细菌细胞壁的合成,以上分类仅对常用的重要的抗生素进行了归类，远远不能包括所有抗生素,2009-11-03,8,仅讨论内酰胺类、氨基糖苷类 、四环素类 的理化性质、鉴别反应、杂质检查、含量测定方法和原理，对生物学方法(如异常毒性、热原、降压物质、无菌、生物效价测定法等)不讨论,2009-11-03,9,三、抗生
6、素药物的质量分析：,抗生素药物的质量控制方法,鉴别 检查 含量(效价)测定,2009-11-03,10,官能团的显色反应： -内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应，坂口反应。通常有酸根或金属离子或有机碱，需要鉴别。 光谱法：UV，IR。 IR时，对于存在多晶现象的抗生素，有时对照品与供试品图谱或对照图谱不一致，需用相同溶剂同时对供试品和对照品重结晶，使处于相同晶型后再进行测定；若多晶效应是由于研磨和压片过程中的晶相转变所致，则应采用溶液法测定。 色谱法：TLC，HPLC。用标准品作对照。,1、鉴别方法,生物学法检查抗生素灭活前后的抑菌能力，并与已知含量的对照品对照后进行鉴别。已很少使用,
7、理化方法,官能团的显色反应 光谱法 色谱法,2009-11-03,11,影响产品稳定性的：结晶度，酸碱度，水分或干燥失重等。 控制有机和无机杂质的：溶液的澄清度与颜色，有关物质，残留溶剂，炽灼残渣，重金属等。,特殊检查项目,普通检查项目,2、检查项目,与临床安全性密切相关的：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌 其他：组分分析(如硫酸庆大霉素的“庆大霉素C组分的测定”) ，悬浮时间与抽针试验(如注射用普鲁卡因青霉素)，聚合物(如内酰胺类抗生素)，杂质吸收度(如四环素类抗生素)等。,2009-11-03,12,3、含量(效价)测定,(1) 微生物检定法在适宜条件下，检测抗生素对微生物的抑制
8、作用，计算抗生素的活性(效价)。,微生物检定法 理化方法,方法,浊度法管碟法 (管碟琼脂扩散法),利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法,利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法,抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内呈球面扩散，形成含一定浓度抗生素的球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈,2009-11-03,13,微生物检定法的优点：,灵敏度高、用量小，结果直观 其测定原理恰好与临床应用要求一致，更能
9、确定抗生素的医疗价值 适用范围广：纯度好的、差的制品，已知或新发现的抗生素均适用，同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价 是抗生素药物效价测定的最基本的方法,缺点：,操作步骤多，测定时间长，误差大等,抗生素类药物不断发展，分析方法不断进步，理化方法逐渐取代生物学法，但对于分子结构复杂、多组分的抗生素，生物学法仍是首选的效价测定方法,2009-11-03,14,(2) 理化方法,适用于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素。根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应进行测定。,优点：,迅速、准确、有较高的专属性,缺点：,对含有具同样官能团杂质的供试品不适用，或需采取适当方
10、法加以校正。而且当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时，所测得的结果，往往只能代表药物的总的含量，并不一定能代表抗生素的生物效价。,药典收载的理化方法主要是HPLC法,内酰胺类，四环素类，大环内酯类大多采用HPLC法测定含量,2009-11-03,15,以效价单位表示，指每毫升或每毫克中含有某种抗生素 的有效成分的多少。用单位(u)或微克(g)表示。,如：1mg庆大霉素 定为 590单位； 1mg青霉素钠 定为1670单位,3、抗生素活性表示方法：,对于维生素类药物，其效价为每克供试品中所含维生素的国际单位数(IU/g),一种抗生素有一个效价基准，它们是为生产科研的方便而规定的，称为
11、抗生素的理论效价，实际上样品的效价往往低于理论效价。,2009-11-03,16,第二节 -内酰胺类抗生素的分析,2009-11-03,17,-内酰胺环结构是抗菌活性的基本药效团,青霉素是从青霉菌培养液中提炼得到，天然的青霉素有7种，其中青霉素G含量最高，疗效最好。 青霉素的钠盐或钾盐均易溶于水，但是其钠盐或钾盐的水溶液在室温下不稳定，易被水解失效，因此注射用青霉素为其钠盐或钾盐的灭菌粉末。 此外有半合成青霉素，如阿莫西林，氨苄西林等，扩大抗菌谱，增强抗菌活性。,头孢菌素是由与青霉菌近缘的头孢菌属真菌产生的抗生素之一，对其进行结构改造，得到抗菌谱广，抗菌活性强的类似物。,2009-11-03,
12、18,头孢菌素族,青霉素族,一、化学结构与性质,*,*,*,母核：6-氨基青霉烷酸(6-APA),母核：7-氨基头孢烷酸(7-ACA),侧链：酰胺基，羧基； 环：内酰胺环与氢化噻唑环并合,侧链：酰胺基，羧基； 环：内酰胺环与氢化噻嗪环并合,手性碳原子：3个,手性碳原子：2个,*,*,2009-11-03,19,青霉素族,磺苄西林钠,哌拉西林(钠),阿莫西林(钠),氨苄西林(钠),青霉素钠(钾),苯唑西林钠,青霉素V钾,2009-11-03,20,普鲁卡因青霉素,氯唑西林钠,苄星青霉素,2009-11-03,21,头孢菌素族,头孢噻肟钠,头孢曲松钠,头孢氨苄头孢羟氨苄头孢克洛头孢拉定,2009-
13、11-03,22,头孢他啶,头孢地尼,头孢呋辛钠,头孢呋辛酯,头孢哌酮(钠),2009-11-03,23,头孢硫脒,头孢替唑钠,头孢噻吩钠,青霉素族与头孢菌素族药物的性质、鉴别、特殊杂质检查、含量测定方法见教材表11-1,头孢唑啉钠,2009-11-03,24,(1)酸性与溶解性：有游离羧基，酸性强，能与无机碱或有机碱形成盐。碱金属盐溶于水，其水溶液遇酸又析出游离基的白色沉淀。临床常用其碱金属盐（水溶性好）。有机碱盐难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂 (2)旋光性：存在手性碳，具有旋光性。可用于定性和定量分析。(3)UV吸收特性：头孢菌素族母核有共轭结构，侧链有共轭系统；青霉素族母核虽无共轭结构，
14、但侧链有苯环等取代基。(4)-内酰胺环的不稳定性： -内酰胺环是结构活性中心，性质活泼，最不稳定。稳定性与含水量和纯度关系很大。干燥条件下性质较稳定(室温条件下密封保存可贮存3年以上)，水溶液很不稳定，随pH和温度不同有很大变化。青霉素在pH66.8时较稳定。在酸、碱、青霉素酶、羟胺、重金属离子或氧化剂作用下，易水解，重排，使-内酰胺环破坏，失去抗菌活性(降解反应见课本p268-269)。,性质,2009-11-03,25,羟肟酸铁反应 类似肽键的反应(茚三酮反应) 其他呈色反应,二、鉴别试验,呈色反应 各种盐的反应 光谱法 色谱法,药典中的鉴别方法主要为：光谱法(IR)、色谱法(HPLC,
15、TLC),2009-11-03,26,1、呈色反应,(1) 羟肟酸铁反应,青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用，-内酰胺环破裂生成羟肟酸钠，将其调成酸性后，可与高铁离子呈色。如ChP(2005)中头孢哌酮、磺苄西林钠、哌拉西林(钠)用此法鉴别,2009-11-03,27,头孢氨苄，头孢羟氨苄，头孢拉定，头孢克洛等有-氨基酸结构，能显茚三酮反应，显紫色或兰紫色。用于TLC鉴别或检查时作显色剂。,(2) 茚三酮反应,(3) 其它呈色反应,与重氮苯磺酸的偶合反应 铡链有酚羟基结构时，能与重氮苯磺酸偶合显色。如阿莫西林，头孢羟氨苄 硫酸-甲醛显色(BP),头孢氨苄头孢羟氨苄头孢克洛头孢拉啶,2009-1
16、1-03,28,2、各种盐的反应,钾、钠离子的焰色反应：临床上常用碱金属盐，可用焰色反应来鉴别碱金属。,3、光谱法,IR各国药典对收载的-内酰胺类抗生素几乎均采用了IR法进行鉴别,UV测定供试液的最大吸收波长或最大吸收波长处的吸收度进行鉴别,例：头孢唑林钠(ChP2005)的鉴别方法中用UV鉴别：取本品适量，加水制成每1ml 中约含16g 的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录 A ）测定，在272nm 的波长处有最大吸收,2009-11-03,29,例： (ChP2005)的鉴别方法中头孢拉定的鉴别：取本品与头孢拉定对照品适量，分别加水溶解并稀释制成每1ml中约含6mg 的溶液，作为供试品溶液
17、与对照品溶液。照薄层色谱法(附录 B)试验，吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板经105活化后，置5%(ml/ml)正十四烷的正己烷溶液中，展开至薄层板的顶部，晾干上，以0.1mol/L枸橼酸溶液-0.2mol/L磷酸氢二钠溶液-丙酮(60：40：1.5)为展开剂，展开，晾干，于105加热5分钟，取出，立即喷以用展开剂制成的0.1%茚三酮溶液，在105加热15分钟后，检视。供试品溶液所显主斑点的颜色与位置 应与对照品溶液所显主斑的颜色与位置相同。,4、色谱法,高效液相色谱法（HPLC）,一般规定在含量测定项下的色谱图中，供试品与对照品主峰的保留时间一致。中国药典收载的头孢菌素族药物
18、和大多数青霉素族药物采用HPLC法进行鉴别。,薄层色谱法（TLC）,比较供试品与对照品主斑点的比移值与颜色。,比较供试品与对照品主峰的保留时间。,2009-11-03,30,三、特殊杂质的检查,高分子聚合物 有关物质 异构体抽针与悬浮时间(注射用普鲁卡因青霉素),一般采用HPLC法控制其量,有效性试验,也有测定杂质的吸光度控制杂质量,取本品1 瓶，按每40万单位加水1ml 使成混悬液，摇匀，静置2 分钟，不得有颗粒下沉或明显的分层。用装有41/2号针头的注射器抽取，应能顺利通过，不得阻塞,2009-11-03,31,色谱柱 葡聚糖凝胶柱 流动相A：含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲
19、液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水1000mL使溶解，调节pH值至7.0） 流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠溶液 流速：每分钟1mL； 检测波长：254nm。 对照品溶液的制备 取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶100g/1mL的溶液，摇匀。 测定法 取本品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶20mg/1mL的溶液，立即进样200L，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200L注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%。,1、聚合物HPLC法,例：ChP2005中头孢他啶聚合
20、物的检查：,-内酰胺类抗生素检查聚合物的药物见教材表11-1,2009-11-03,32,2、有关物质和异构体,-内酰胺类抗生素中的有关物质和异构体常采用色谱法检查。,例1： 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查用HPLC法检查,例2：头孢氨苄中有关物质检查,-内酰胺类抗生素检查有关物质和异构体的药物见教材表11-1,(见教材),2009-11-03,33,取本品，加水制成每1mL中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波长处测定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波长处有最大吸收，吸光度应为0.800.88。,用来控制青霉素钠（钾）的含量,用来控制杂质的量,3、吸光度,例：Ch
21、P2005中青霉素钠（钾）的吸光度检查：,4、有机溶剂,一般用GC法检查，个别用HPLC法检查,2009-11-03,34,少数样品用微生物检定法，大多采用理化测定法。,四、含量测定,中国药典中收载的本类药物，除磺苄西林钠采用微生物检定法外，其他均用HPLC法,此外，中国药典曾用过降解后剩余碘量法、电位配位滴定法、硫醇汞盐测定本类药物的含量,2009-11-03,35,HPLC法是-内酰胺类抗生素含量测定的最主要方法。近年来发展快速，能有效分离供试品中可能存在的降解产物、未除尽的原料及中间体等杂质，并能准确定量，对本类药物的原料药、制剂、生物样本均能测定。,本类药物的HPLC法通常采用反相HP
22、LC，以外标法计算含量,2009-11-03,36,色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：ODS柱 流动相：缓冲液取磷酸二氢钾14g和40%氢氧化四丁基胺溶液6.5g 溶解于约 70ml水中，用1mol/L氢氧化钾溶液调节pH至7.0，用水稀释至1000ml，混匀-水-乙腈（52：23：25）并用1mol/L氢氧化钾溶液或10%稀磷酸溶液调节pH至7.50.05 检测波长：235nm。 取青霉素V钾对照品适量，用流动相溶解并稀释成每1ml中含青霉素V钾2.4mg的溶液，将此溶液与对照品溶液以1：3体积比混合，进样测定，青霉素和青霉素V的分离度应不小于2.0。,例：注射用普鲁卡因青霉素的含量测定,测
23、定法 供试品溶液：取装量差异项下的内容物，精密称取适量，配成1.4mg/ml(流动相溶解并稀释) 对照品溶液(1)：青霉素对照品溶液：含青霉素0.8mg/ml，流动相溶解并稀释。 对照品溶液(2)： 盐酸普鲁卡因对照品溶液：含普鲁卡因0.54mg/ml，流动相溶解并稀释。 各精密量取10l注入液相色谱仪，记录色谱图。 计算： 按外标法以峰面积计算供试品中C13H20N2O2(普鲁卡因)和C16H18N2O4S(青霉素)的含量：每1mg的C16H18N2O4S相当于1780青霉素单位。规定：按无水物计算，含青霉素应为59.0%66.3%，含普鲁卡因应为29.1%35.6%，每1mg 含青霉素应为
24、10501180单位，按平均装量计算，含青霉素应为标示量(40万单位 或80万单位 )的95.0105.0。,对于青霉素： CX/C对=AX/A对 CX=(AX/A对)C对 青%=(CX/C配) 100% 对于普鲁卡因： CX/C对=AX/A对 CX=(AX/A对)C对 普%=(CX/C配) 100% 按平均装量算，每瓶含纯品青霉素：W平均青% 每1mg的C16H18N2O4S (青霉素)相当于1780青霉素单位，故每瓶的纯品青霉素为W平均青% 1780单位 标%=(W平均青% 1780)/标示量 100%,2009-11-03,37,2、碘量法,利用青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，而其水解产物
25、消耗碘的性质，采用剩余碘量法测定，以标准对照法计算含量。,以青霉素为例：,反应分两步： 第一步：青霉素在碱性条件下水解，该步反应是按化学计量进行的 第二步：水解生成的青霉噻唑酸在酸性条件下与定量过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠滴定 同时做空白试验以消除杂质的影响，并用青霉素标准品进行平行对照测定以消除温度，pH，时间等因素的影响,2009-11-03,38,式中：S0、R0分别为滴定供试品空白液和对照品空白液消耗的硫代硫酸钠溶液的体积（mL）； S、R分别为滴定供试品和对照品消耗的硫代硫酸钠溶液的体积（mL）； C为对照品浓度（g/mL）； U、U0分别为对照品的效价（单位/毫克）和样品的标
26、示量； W、D分别为供试品取样量（g）和稀释倍数。,2009-11-03,39,青霉素分子不与汞盐反应，而其碱性水解产物如青霉噻唑酸在一定条件下能与二价过渡金属离子如Cu2+、Hg2+形成稳定的络合物。 将青霉素碱性水解后，用硝酸汞标准液滴定,电位法指示终点（滴定中出现两个突跃，以第2个突跃为终点，反应摩尔比为1：1 ）。 由于样品中存在的降解杂质也会消耗硝酸汞，为消除干扰，采用两次滴定法:水解后滴定总量%；直接滴定降解杂质的量%(即空白试验)则：样品含量% =总量% 降解杂质的量%,3、电位络合滴定法,2009-11-03,40,第三节 氨基糖苷类抗生素,2009-11-03,41,它们的抗
27、菌谱、抗菌机理和化学性质都有共同之处。,天然的氨基糖 苷类抗生素,链霉菌属：链霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、大观霉素,小单胞菌属：庆大霉素、西索米星、小诺米星、福提米星,半合成氨基糖苷类抗生素 硫酸依替米星、硫酸奈替米星、阿米卡星等,2009-11-03,42,一、化学结构与性质,链霉素,第一个用于临床的氨基糖苷类抗生素，亦是第一个抗结核药,结合较弱,结合较牢,2009-11-03,43,庆大霉素,临床最常用的氨基糖苷类抗生素,2009-11-03,44,溶解度与碱性：分子中具有多个羟基和碱性基团，同属碱性、水溶性抗生素，能与无机酸或有机酸成盐。临床上常用的为硫酸盐，易溶于水，不溶于有机溶
28、剂； 旋光性：分子结构中含有多个氨基糖，具有旋光性； 苷的水解与稳定性：链霉素的硫酸盐水溶液在pH57.5最为稳定，过酸或过碱均易水解。在碱性条件下水解，链霉素水解为链霉胍和链霉双糖胺，并使链霉糖部分发生分子重排，生成麦芽酚(为链霉素所特有的性质)；硫酸庆大霉素，硫酸奈替米星对光、热、空气均较稳定，水溶液也较稳定。 UV吸收：链霉素在230nm处有紫外吸收，其它本类药物基本无UV吸收。,性质：,2009-11-03,45,茚三酮反应本类抗生素具羟基胺类和-氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色化合物。,二、鉴别试验,坂口（Sakaguchi）反应为链霉素水解产物链霉胍的特有反应。链霉素水溶液加氢
29、氧化钠试液，水解生成的链霉胍，链霉胍和8-羟基喹啉分别与次溴酸钠反应，二者反应产物再相互作用生成橙红色化合物。,2009-11-03,46,麦芽酚（Maltol）反应为链霉素的特征反应。在碱性溶液中，链霉素水解为链霉胍和链霉双糖胺，并使链霉糖部分经分子重排、扩环、消除反应，生成麦芽酚，与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。,2009-11-03,47,Molisch试验 N-甲基葡萄糖胺反应 硫酸盐反应 光谱法：UV、IR 色谱法：TLC、HPLC 等,此外，,2009-11-03,48,链霉素B是指甘露糖链霉素，由发酵产生, 其生物活性仅为链霉素的20%25%，能被甘露糖链霉素B苷酶水
30、解成甘露糖和链霉素。ChP2005增加了该项检查，采用薄层色谱法检查。 供试品溶液： 10mg / 1ml 甘露糖对照溶液： 72g / 1ml(相当于含链霉素B 0.3mg / ml) 薄层板：硅胶G 展开剂：甲苯-醋酸-甲醇（50：25：25） 点样量：10l 显色剂：新鲜配制的0.2%1，3-苦二酚乙醇溶液与20%硫酸溶液等体积混合液 判定法：供试品溶液所显链霉素B斑点的颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深（3.0%）。,三、特殊杂质检查及组分分析,1、链霉素中链霉素B的检查,2009-11-03,49,奈替米星是西梭米星化学衍生得到的半合成抗生素，成品中有可能残留西梭米星，需对其进行控
31、制。 供试品溶液：150mg / mL； 标准品溶液（1） 1.5mg / mL；奈替米星（2） 3mg / mL；奈替米星（3） 1.44mg/mL，西梭米星 点样：各2L， 展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨溶液（4：4：2） 显色：0.2%茚三酮溶液，110加热20min。 规定：供试溶液若显杂质斑点，其颜色与标准品溶液(3)所显主斑点相比较，不得更深(1%)，其他杂质与标准品溶液(1)所显主斑点相比较，均不得更深，如有一点超过，应不深于标准品溶液(2)的主斑点(2%)。,2、硫酸奈替米星中有关物质的TLC检查：,2009-11-03,50,庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性无明显差异，
32、但其毒副作用和耐药性有差异，导致各组分的多少影响产品的效价和临床疗效。因此各国药典均规定控制各组分的相对百分含量。 例：庆大霉素C组分测定(ChP2005) 色谱柱：ODS柱（pH值范围0.88.0）； 流动相：0.02mol/L三氟醋酸-甲醇（92：8）； 流速：每分钟0.6ml； 检测器：蒸发光检测器（参考条件：漂移管温度110，载气流量为每分钟2.8L）。,3、庆大霉素C组分测定,2009-11-03,51,C组分的出峰顺序依次为庆大霉素C1a、C2、小诺霉素、C2a、C1 测定法： 取小诺霉素标准品适量，精密称定，分别用流动相制成每1ml 中约含小诺霉素0.2mg、0.5mg和1.0m
33、g的溶液作为标准品溶液(1)、(2)、(3)。取上述三种溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算标准品溶液浓度的对数值与相应的主峰面积对数值的回归方程，相关系数(r)应不小于0.99；另取本品适量，精密称定，用流动相制成每1ml中约含庆大霉素2.5mg的供试品溶液，同法测定，用回归方程计算供试品中对应各组分的量（Xcx），并根据所得的各组分的量（Xcx）按下面公式计算出各组分的含量。XcxCx()100 Xc1a+Xc2+Xc2a+Xc1式中 Cx为庆大霉素各组分的含量；C1应为2550，C1a应为1540，C2C2a应为2050。,2009-11-03,52,氨基糖苷类抗生素临床上
34、主要用硫酸盐，各国药典规定EDTA络合滴定法测定硫酸盐含量，作为组分分析。例：硫酸奈替米星中硫酸盐的测定取本品约0.12g，精密称定，加水100ml使溶解，用浓氨溶液调节pH值至11后，精密加氯化钡滴定液(0.1mol/L) 10ml、酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L) 滴定，注意保持滴定过程中的pH值为11，滴定至紫色开始消褪，加入乙醇50ml，继续滴定，至蓝紫色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml氯化钡滴定液(0.1mol/L)相当于9.606mg硫酸盐(SO4)，本品含硫酸盐的量按无水物计算应为31.535.0。,4、硫酸盐的含量,2009-11-03
35、,53,氨基糖苷类抗生素的效价测定目前各国药典主要采用微生物检定法和HPLC法。理化分析方法文献报道逐渐增多。,氨基糖苷类抗生素的分析方法,微生物法 自动免疫分析法用于治疗药物监测 HPLC法用于药动学、代谢物、稳定 性等研究。需进行柱前或柱后衍生化。,四、含量测定,2009-11-03,54,第四节 四环素类抗生素,四环素类抗生素是放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素及半合成四环素类抗生素。 这类抗生素分子有四个环构成，故统称为四环素类抗生素。,2009-11-03,55,天然的四环素类抗生素中金霉素因毒性大，只作外用。 土霉素和四环素现在在临床上也已少用，主要用作兽药和饲
36、料添加剂。 结构改造后得到半合成四环素类抗生素。例如多西环素、米诺环素等。米诺环素在四环素类抗生素中抗菌作用最强，具有高效、长效作用。,2009-11-03,56,一、化学结构与性质化学结构：四环素类抗生素，可以看作四骈苯或萘骈萘的衍生物，基本结构如下：,该类药物有共同的A、B、C、D四个环的母核，仅在5、6、7位上有不同的取代基。,2009-11-03,57,1、酸碱性与溶解度 2、旋光性 3、紫外吸收和荧光性质 4、与金属离子形成配位化合物 5、稳定性,C4位上二甲氨基显弱碱性，C10位上酚羟基和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统显弱酸性，故四环素类是两性化合物。遇酸及碱，均能成盐。临床上
37、多应用盐酸盐。盐酸盐易溶于水及酸性或碱性溶液中，不溶于有机溶剂。游离碱在水中溶解度很小，其溶解度与溶液 pH值有关。,四环素类抗生素分子结构中有不对称碳原子，故具有旋光性。药典中规定要测定其比旋度。,分子中有共轭双键系统，在紫外光区有吸收。本类抗生素在紫外光下产生荧光，它们的降解产物也有荧光，如土霉素经碱降解后呈绿色荧光，加热，转为蓝色荧光。,结构中的酚羟基与烯醇基可与金属离子形成不溶性盐类(如钙盐、镁盐)或配位化合物(如铁的红色，铝的黄色配合物)。可用于鉴别。,四环素类抗生素对各种氧化剂（包括空气中氧在内）、酸、碱都是不稳定的。干燥时避光保存较稳定，水溶液易发生差向异构化、降解等反应。碱性水
38、溶液特别容易氧化，颜色很快变深，形成色素。,性质,2009-11-03,58,四环素类抗生素在弱酸性（pH2.06.0）溶液中会发生差向异构化。这个反应是由于A环上手性碳原子C4构型的改变，发生差向异构化，形成差向四环素类，而失去抗菌能力。,四环素和金霉素易差向异构化，土霉素、多西霉素、美他环素C5位上有羟基，可与C4位上的二甲氨基形成氢键，比较稳定，不易发生差向异构化。磷酸根、枸橼酸根、醋酸根加速异构化反应。,（1）差向异构化性质,2009-11-03,59,（2）降解性质,酸性降解：在酸性条件下（pH2），特别是在加热情况下，四环素类抗生素C6上的醇羟基和C5a上的氢发生反式消去反应生成脱
39、水四环素（ATC）。其共轭双键数目增加，使四环素色泽加深,四环素和多霉素易发生该降解,2009-11-03,60,碱性降解：在碱性溶液中，由于氢氧离子的作用，C6上的羟基形成氧负离子，向C11发生分子内亲核进攻，经电子转移，C环破裂，生成无活性的具有内酯结构的异构体,脱水四环素也会形成差向异构体，称为差向脱水四环素,2009-11-03,61,二、鉴别试验,1、呈色反应,浓硫酸反应四环素类抗生素遇硫酸立即产生各种颜色，可区别各种四环素类抗生素。,见教材,三氯化铁反应本类抗生素分子结构中具有酚羟基，遇三氯化铁试液即呈色,2、TLC法 3、HPLC法 4、IR法 5、UV法,2009-11-03,
40、62,四环素类抗生素中的有关物质主要是指在生产和贮藏过程中易形成的异构杂质、降解杂质（ETC、ATC、EATC）等。中国药典和USP、BP均采用高效液相色谱法控制四环类抗生素的有关物质。 例：盐酸多西环素中有关物质检查(ChP2005) 供试品溶液： 0.2mg / 1ml(溶剂：0.01mol/L盐酸溶液) 对照溶液：用供试品溶液稀释成4g / 1ml (稀释剂：0.01mol/L盐酸溶液) 杂质对照液：精密称取土霉素对照品、美他环素对照品、多西环素对照品及多西环素对照品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解制成每 1ml中分别约含0.08mg的混合溶液 检查：照含量测定项下的色谱条件，供试
41、品溶液色谱图中如有杂质峰，土霉素峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2（1.0），美他环素与多西环素峰面积分别不得大于对照溶液主峰 面积（2.0）。,三、特殊杂质检查,1、有关物质,2009-11-03,63,四环类抗生素多为黄色结晶性粉末；而异构体、降解产物颜色较深，此类杂质的存在均可使四环素类抗生素的外观色泽变深。因此中国药典和BP（2000）均规定了一定溶剂、一定浓度、一定波长下杂质吸收度的限量。 盐酸多西环素中杂质吸收度(ChP2005) 取本品，精密称定，加盐酸溶液(9100)的甲醇溶液(1100)溶解定量制 成每1ml 中含10mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录 A），在49
42、0nm 的波长处测定，吸光度不得过0.12。,2、杂质吸收度,2009-11-03,64,四、含量测定,四环素类抗生素的含量测定，目前各国药典多采用HPLC法。 例：盐酸多西环素 的含量测定(ChP2005) 色谱柱：ODS柱 (PH值适用范围应大于8)； 流动相：0.05mol/L草酸铵溶液二甲基甲酰胺0.2mol/L磷酸氢二铵溶液（65:30:5）用氨试液调节PH值为8.00.2； 柱温：35； 检测波长：280nm。 精密称取土霉素对照品、美他环素对照品、多西环素对照品及 多西环素对照品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解制成每 1ml中分别约含0.08mg的混合溶液，进样测试。理论板
43、数按多西环素峰计算应不低于 1500，多西环素峰与多西环素峰的分离度应符合规定。测定法：取本品40mg，精密称定，置50ml量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶 液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加 0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，取20l注入液相色谱仪，记录 色谱图；另取多西环素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算 供试品中C22H24N2O8 的含量。,2009-11-03,65,思考题： 1、典型的青霉素类药物有哪些？ 2、青霉素类药物的含量测定方法有哪几种？ 3、HPLC法测定青霉素类药物如何计算含量？ 4、氨基糖苷类抗生素的主要鉴别方法有哪些？麦芽酚反应和坂口反应是用来鉴别哪个抗生素？ 5、四环素类抗生素的不稳定性表现在什么方面？,
