1、第七章 核 酶 工 程,1981年Cech等发现四膜虫的核糖体前体RNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子，完成加工过程。,该具有催化活性的RNA的发现改变了传统上“酶是蛋白质” 的观念，从此对具有催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)的结构、催化机制以及应用的研究日益深入。,核酸分子在总体的催化潜力上和蛋白质相差甚远，但由于可以遗传和变异而被自然界保留下来催化一些特殊的反应。,核酶由于具有许多优点而受到重视，例如用于治疗的核酶注射入体内不会产生免疫原性，对具有切割活力的核酶可以更加自由的设计其切割RNA的位点。,分子进化工程的诞生，使核酶的研究迅速发展，人工进化出自然界中不
2、存在的多种功能的核酶（包括单链DNA酶），这些研究成果在理论和实际应用中都有着巨大的意义。,第一节天然核酶,目前为止，在自然界中发现的核酶根据其催化的反应可以分成两大类： 剪切型核酶 核酸酶 剪接型核酶,1、剪切型核酶 催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶。 主要包括锤头型核酶，发夹型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶，以及有蛋白质参与协助完成催化的RNaseP,2、剪接型核酶 实现mRNA前体自我拼接，具有核酸内切酶和连接酶两种活性。 主要包括组I内含子和组II内含子,一 锤头型核酶,R. Symons等在比较了一些植物类病毒、抗病毒和卫星病毒RNA自身剪切规律后提出锤头结构（ham
3、merhead structure）状二级结构模型。,它是由13个保守核苷酸残基和三个螺旋结构域构成的。 （后来Koizumi等证明只需要11个特定保守核苷酸）。,锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图a中N,N代表任意核苷酸；X 可以是A、U或者C,但不能是G；I、II和 III是锤头结构中的双螺旋区；箭头指向切割位点。 b 是锤头型核酶的立体结构模型，白色链是核酶，灰色链是底物RNA分子，在磷酸骨架上结合有镁离子,Symons等认为，只要具备锤头状二级结构和13个保守核苷酸，剪切反应就会在锤头结构的右上方GUX序列的3端自动发生。无论是天然的还是人工合成的锤头结构都由两部分构成：催化结构
4、域（R）和底物结合结构域（S）。,William B. Lott等提出了锤头型核酶催化反应的两种可能的化学机制： “单金属氢氧化物离子模型” “双金属离子模型”)。,锤头型核酶的两种可能的催化机制以及HDV核酶的催化机制单金属氢氧化物离子模型，(b)双金属离子模型，(c)HDV 核酶中胞嘧啶充当一般碱进行催化的反应机理,二 发夹型核酶,发夹型核酶的二级结构模型,50个碱基的核酶和14个碱基的底物形成了发夹状的二级结构，包括4个螺旋和5个突环。螺旋3和4在核酶内部形成，螺旋1(6碱基对)和2(4碱基对)由核酶与底物共同形成，实现了酶与底物的结合。核酶的识别顺序是(G/C/U)NGUC，其中N代表
5、任何一种核苷酸，这个顺序位于螺旋1和2之间的底物RNA链上，切割反应发生在N和G之间。,三 蛋白质-RNA复合酶(RNaseP),蛋白质-RNA复合酶主要催化tRNA前体成熟过程。 例如S. Altman和N. Pace两个研究组合作发现的大肠杆菌tRNA5成熟酶。,蛋白质-RNA复合酶酶由蛋白质和M1RNA两个组分构成 蛋白质的分子量为20kDa， M1RNA含有377个核苷酸。 M1RNA单独具有全酶活性， 蛋白质只是维护M1RNA的构 象。,实验证明来自不同原核细胞RNaseP中的M1RNA具有相似的三维结构。 与前面几种剪切型核酶不同的是，RNaseP催化得到的产物的3端是羟基，5端是
6、磷酸。,四 组I内含子和组II内含子,组I内含子(group I intron)和组II内含子(group II intron) 这类核酶比较复杂，通常包括200个以上核苷酸，主要催化mRNA前体的拼接反应。,像蛋白质酶一样，内含子形成高级结构的折叠结果使关键残基形成活性部位，在辅助因子的参与下实现自身剪接。,组I内含子能够自身剪接的是与它们保守的二级和三级结构有关。,除了剪接之外，组内含子还可催化各种分子间反应，包括剪切RNA和DNA、RNA聚合、核苷酰转移、模板RNA连接、氨酰基酯解等。,在体外，组内含子的剪接是经过两个转酯化反应来实现的，无蛋白质参与。,组和组内含子的主要差别是第一步反应的化学机制。,在组内含子中，外部的鸟苷的3-羟基作为进攻基团，而在组内含子中是内部腺苷的2-羟基起作用(图 7-4b)。,这个反应的结果形成一个带突环的内含子-3外显子分子，其中第一个核苷酸经由2，5-磷酸二酯键与内含子的A相连。在第二步反应中，5外显子的3-羟基进攻内含子-3外显子连接点，结果是两个外显子相连，并释放出带有突环的内含子。,
