1、提取 RNA（以下步骤都在冰盒中进行）1. TRLzol 加入培养皿中（1ml） ，静置 5min 后，将每个面都吹一下，转入1.5ml 的离心管（附一）2. 加入氯仿，量为 TRLZOL 的五分之一，悬空打入，然后摇匀静置 5min，然后离心：4，12000g，15min3. 吸取三层中最上层的水层，加入等量的异丙醇，悬空打入，混匀，静置10min，离心:4，12000g，10min，吸去上清液4. 加入 1ml 的 75的乙醇，离心：4，12000g，5min（重复两遍）5. 吸干酒精，静置 10min 使酒精风干，再加入 20l 的 DEPC 水，加入后吹打几下，使 RNA 溶解。6.
2、用 DEPC 水稀释 10-20 倍，每份总量为 10l，既 9l 的水和 1l 的 RNA，测 RNA 浓度（附二）7. 逆转录，总体系 10l，RNA 加入量不超过 500ng，但是尽量靠近 500ng。5Prime 2lRT Enzyme 0.5lPrimer 0.5lRandom 0.5lRNADEPC 水8. 先配好前四样的混合液，后两样根据测的 RNA 浓度计算，保证 RNA 不超过500ng9. 按照要求加入药品，放入仪器中，设置 HAO，10l 逆转录。10. 转录完成后，取 1l 的样品，稀释 10 倍，用 Q5000 测浓度，一般都是120-130，所以可以稀释 13 倍，
3、使 cDNA 不超过 100ng。11.PCR 体系：SYBR GREEN 12.5lDEPC 水 10.5l前引物 0.5l后引物 0.5lDNA 模版 1l6.5 l10 l算好总量，提前混合使用前离心，再根据说明书溶解成母液，再稀释 10 倍成为工作液12. 前后引物和模版稀释后都需要涡旋离心。加入 SYBR GREEN 需要避光，准备八连管。13.PCR 仪器使用前先打开预热 30min，打开 GFX manager 软件，File 里打开Protocol，选择设定好的程序，再点 next，设定 plate ， setting 里的Target（目标名称）和 Sample（样品名称）1
4、4. 选择样品位置，名称，直到显示点击开始运行。附一：台内操作手套在细胞间拿，所有物品进入都需酒精灭菌，离心管需用镊子夹出使用，出操作台要带上一层一次性的手套防止污染。附二：测浓度需要用一组空白的溶剂进行 BLANK，确定基线。 ，每份样品涡旋离心使其浓度均匀。使用 Q5000 进行测量BLANK 空白校准Measure 测样品浓度Sample type 测量种类260/280 纯度，2.0 左右，不低于 1.8260/230 有机残留，2.0 左右每次用完都用二次水湿润的纸擦一次，干燥的纸擦一次，每个样品测三次。导出到 Excel。退出系统 exit关闭机器，罩上罩子。UNK目标引物名称样品名称
