1、PCR 疑难解答当 PCR 结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：将 PCR 反应的试管与反应板紧贴。当酶反应混合物以 70“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在 0.2-ml 的 PCR 管中不能均匀传热。不要随意减少 dNTP 的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。对于有问题的 PCR 反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加 Taq 酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常 PCR 扩增。没有扩增产物：在提供 MgCl2 缓冲液中，以 0.25mmol/L 为梯度增加 MgCl2 浓度；无 MgCl2 的缓冲液以0.5 mmol/L 为梯
2、度增加 MgCl2 浓度。泳道中出现模糊条带，如果 DNA 模板中存在 RNA，则按上述提示浓度补加 MgCl2，因为在 PCR 反应中可能缺少游离的 Mg2+。检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。检查模板和引物的用量。增加循环次数和/或模板 DNA 的用量。泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板 DNA 的用量。提高退火温度，但不要超过 68。重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：建议使用 0.2-ml 薄壁管。厚壁管在 92时不能有效地使模板变性。最佳反应体积为 50ml，推荐用 30ml 矿物油覆盖（对盖子加热的 PCR 仪可以不加） 。大多数反应中，0.
3、75ml（0.51ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。建议使用 1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP 或 2.25mmol/L MgCl2500mmol/L dNTP 组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化 Mg2+的浓度是必需的。基因组 DNA 模板的质量显著影响 PCR 反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA的长度。DNA 片段长度可以超过 50kb，传统的基因组 DNA 能扩增片段至 10kb。要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的 DNA。请查阅高分子量 DNA 提取操作过程相关文献。降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段 PCR 扩
4、增时，引物长度一般为2434 个核苷酸，溶点在 6068间。使用这类引物可提高 PCR 反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。变性：第一步变性在 94下进行 2 分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94下进行20-30 秒） ，除非模板中富含 GC，则 95下变性 30 秒。这可以防止 DNA 脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组 DNA 片段终长度超过 12 kb 时，应该尽可能的降低变性温度。延伸：68-72下进行延伸操作。循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若 PCR 仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增 10kb
5、片断时，延伸时间用 10 分钟替代原来的 8 分钟。长片断 PCR 系统扩增的片断其 3-末端带有一个突出的 A，因此建议采用 T/A 克隆。若要进行平端可隆，可用 Klenow 酶和 T4 DNA 多聚酶将 PCR 产物补平后再进行。测序时因酶的混合物带有 35外切酶活性，用 Sanger 方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。引物设计：一般长度 20-30bp；至少 50%的 GC 含量；避免引物二聚体和二级结构；引物对的 Tm 值应该接近。也可下列图示提示找到解决问题的突破口： 9、PCR 扩增过程中若干影响因素？引物：在 Tris 缓冲液中，引物可以低温保存相当长的时间。除非有核酸
6、酶的污染，引物一般非常稳定。笔者使用过10年前的引物，仍然好用。问题的关键在于您的引物设计是否合理，使用过程是否规范。如果您怀疑引物有问题，可以选择重合。如果重合后，还没有改善，请查其他原因。引物到用户手头前都是以干粉形式存在的，干粉很容易丢掉，引物溶解后可以测定一下 OD，将所有引物的浓度调整到一致，对实验有一定帮助。高温聚合酶：高温聚合酶是非常稳定的，除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供的酶扩增是有差异的，活性定量和标示未必相同。选用表现一贯稳定的酶，而不是最便宜的。当然，便宜又好最好，哪里有？我们这里啊！dNTP: dNTP 是 PCR 扩增体系中最不稳定的，反复冻融会使 dNTP 发生
7、降解。dNTP是由 dATP,dCTP,dGTP,dTTP 等摩尔组成，但是他们的稳定性不同，发生降解的程度不同，导致4种 dNTP 的浓度不一致，即使不发生降解，4 种 dNTP 如果浓度不等，PCR 效率和正确率都会受到影响。建议分装小包装，减少反复动容冻融的次数。缓冲液：缓冲液一般不容易出问题，只是使用前需要彻底融化混匀使用。如果您 PCR不熟悉，使用含 Mg 的缓冲液。缓冲液中可以加入适量的甘油、DMSO 等增强剂，目的是改善高 GC 含量等疑难模板的扩增。Mg2+:是 TAQ 活性所必须的，浓度过高过低对反应都有比较大的影响。过低（3mM） ，非特异性会加大。很多因素会使 Mg2+的
8、实际浓度受到影响，如 TE 中的 EDTA, 反应用的 dNTP 等都会螯和 Mg.温度：变性和退火温度是主要需要考虑的。变性温度过高（一般在90-94C） ，时间过长（一般45-60 秒足够） ，酶的活性会受到影响，同时影响产率。对于退火温度，过低非特异性扩增增加，过高产率会下降。需要根据引物的长度，用途，组成确定退火温度和时间。模板：PCR 的关键之一，模板不是越多越好。可以通过倍比稀释来确定合适的浓度。纯度,不是最重要，但是不能有抑制 Taq 活性或螯和 Mg 的试剂存在。模板的 pH 值接近中性为合适，否则会影响扩增体系的 pH 值。PCR (Polymerase chain reac
9、tion) 是用一对寡聚 DNA 作为引物，通过加温变性退火DNA 合成这一周期的多次循环，使目的 DNA 片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经2530个循环后，扩增倍数可达10 6。Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；（二）基本要素1 Taq DNA 聚合酶：水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的 DNA 聚合酶53 DNA 聚合酶活性；无35 外切酶活性，35轮0.25%错配，与原始模板有差别；最适聚合酶 温度72，选择 72延伸半衰期：92.5 130min95 40min97.556min变性温度：95使其在
10、整个扩增循环中保持足够活性 pfu DNA 聚合酶耐热53DNA 聚合酶活性35外切酶活性精确度：pfu Taq但 pfu 扩增效率通常比 Taq 酶略差文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果（2）Primer 本身不要出现内部互补序列 形成 loop 环，内部二级结构 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （3）注意减少 Primer 间互补序列 导致2个 Primer 形成 dimer 一般不要超过3个互补 bp （4）Primer 5未端可修饰、突变:修饰 如： 32P、生物素、荧光素，不影响其效果 突变： AGCTCCATGACCCAG 5CGCTCCATGACCCAG 3
11、 注意：绝不可以在 3端进行上述改造 DNA 聚合酶是 53 聚合，若 3端改造不能互补不能延伸(5）primer 5端增加碱基ATG 起始密码 TAA、TAG、TGA 终止密码 如： 可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。3.模板：可选：DNA mRNA逆转录cDNA DNA 包括： 质粒 噬菌体 染色体 DNA 较小 较大 目的 gene 是单拷贝 变性较易 变性较难 非常大，变性难 模板用量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注意： 防止交叉污染 4.dNTP：四种脱氧核苷酸，基本原料终浓度：50mM 注意：不稳定，保 5.Mg2+ TaqDNA
12、 聚合酶作用时需要 Mg2+ 不同的酶需不同 Mg2+ Taq：较少， Mg2+对反应影响很大， 0.5-1.5mM 终浓度 pfu：Mg 2+ 2-3mM，dNTP、primer 用量约增加一倍 外界影响： EDTA 鳌合 Mg2+ 选较低浓度 TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA 模板、引物和 dNTP 的磷酸基团均可与 Mg2+结合， 降低 Mg2+有效浓度。 如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的 Mg2+浓度 存时间长会失效6.温度和时间：（1）变性温度：94-95Templete：GC 比例高、长度很长，则变性 T（2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于 Tm
13、 值：Tm退火 T；Tm退火 T若 Tm 较高，可使退火和延伸在同一温度（3）延伸：500nt-1min 500nt3min一般：4060sec（三）PCR 技术的应用1. 基因检测：2. 基因克隆化3. DNA 突变4. DNA 序列分析PCR 扩增过程中常见的问题及解决方法作者：魏超 来源：sinonir 时间：2006-9-1实验仪器大全实验试剂大全PCR 技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展PCR 研究用应用工作。PCR 技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺
14、利地上马，但毕竟 PCR 技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。在 PCR 技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至会得到与事实完成相反的结果。为了使我们能够顺利地开展 PCR 工作，更好地发挥 PCR 技术的工具作用，我们根据多年来 PCR 工作总结的经验，对 PCR 扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结，提供给广大科研工作者作为参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。 一、 假阳性扩增 在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源，一般应从以下步骤着手： 试剂污染：
15、厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。检测方法，可按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于 PCR 仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水） ，便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。 实验室污染： 这是最常见的污染源，由于 PCR 技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上，扩弗产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然，所用的移液器、吸咀管（离心管）
16、都应彻底更换。解决方法：实验室污染是 PCR 扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严格地分开，不可互换。PCR 室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。 采样污染： 在实验过程中，有时会出现一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反复，这种现象大都是由于采样时污染所致，一般来讲正规试剂生产厂家，其试剂出厂时都要经过严格的质量检测、批间，特别是批内差异都极小，不致
17、出现如此明显的反复，这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR 扩增非常敏感，而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往注不能去除痕量 DNA，这些痕量 DNA 便成为 PCR 模板，出现阳性扩增结果，由于采样试管受污染程度不一，所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。 二、 假阴性扩增： 如果连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假阴性，出现这现象有以下几种原因： 仪器故障： 出现全阴结果，首先考虑到仪器运转是否正常。正确判断仪器的工作状况，是排除假阴性其它原因的基础，仪器运转是否正常是 PCR 扩增最关键的步聚之一。判断
18、仪器是否正常，首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是否答合要求，各孔之间差异是否符合要求，PCR 扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出现假阴性。必须注意的是不能过信名牌，我们经常发现一些名牌机器温度差异高达二度以上。 试剂失效或无效： 了解机器是否正常，便可对试剂进行检测。首先要了解试剂是否超过有效期，试存放方法是否达到要求，如果试剂盒在有效期内，贮存方法是正确，那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以用已知阳性样本，或试剂盒提供的阳性对照，严格按说明书操作扩增一次，然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍，作为模板进行第二次扩增，
19、判断结果，如果是阴性说明试剂无效或不合格，如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。 试剂的敏感度： 有时试剂检测的阳性率偏低，所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，这种现象往往与以下三种因素有关：试剂质量不过关； 操作方法不规范； 主观判断标准不科学。对于试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。这里着重提一下：目前经常碰到的一些不科学概念，我们习惯用某些样本应该阴性，某些样本应该阳性，或简单地以阳性率。主观概念判断试剂是否合格这是极不科学的主观推论。如对乙肝血清的测定，就不能用抽象的阳性率应该是60或20这样的概念来判断，同样也不能用“二对半”的结果评判“PCR 结果 ”，这
20、是因为“二对半”与“ PCR”是两种完全不同的检测方法，其检测结果的意义有质的区别，它为医务人员提供的信息是大不相同的，更加之所使用的“二对半”试剂是否能作为质量评价标准仍待考定。目前世界上较公认的标准品只有雅培的“两对半”试剂，国内的“二对半” 试剂据卫生部抽查资料表明，一度合格率在50以下，怎么可能作为质量评定标准呢！对试剂敏感度的评价标准应该使用下述方法科学地评价，首先选择标准样本如 HBV 全序列质粒，标准阳性血清，结核菌菌体等用合适的介质如血清、痰液等进行有限稀释按1：10、1 ：100、1：1000、1：10000如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一般认为如果标准阳性乙肝的血清用
21、正常血清稀释10000倍以上，结核菌每毫升中在100个左右仍能测出阳性结果时，试剂的敏感度是足够的，判断试剂的灵敏度是足够的，判断试剂的灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，因为病原微生物有不同的型或变异株，合格的试剂不应漏检。最后还要判断试剂盒的异性，一般的实验室可以用不同病原体的样本按说明书操作来判断其对其它病原体扩增时是否也有阳性出现，其特异可达到怎样的精度，经过以上三个方面的研究便可以科学地判断试剂的质量。 三、 扩增产物拖尾 有时扩增产物电泳后出现一个个萤光团（Smear 现象）或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关： 扩增系统不完善： 这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非
22、特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物浓度、DNTP 浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。 模板处理方法不完善： PCR 扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对 PCR 主要成分之一 DNA 聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样作用于聚合酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。 引物设计不合理： 引物设计应遵循以下几个原则。首先，引物一般应由15-30个 BP 组成；其次，
23、引物中碱基应是随机分布，不能有一串相同碱基或出现其它不常见结构；第三，GC 碱基含量应在45-55左右；第四，两个引物在3 未端不能出现同源性。其中以引物与基因组之间的同源性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列，因此我们必须充分利用这些资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其能否用于检测。 四、 产物电泳单萤光带及多萤光带一般 PCR 扩增后，对扩增结果的判断最简单的方法是，琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在320nm 的紫外激发观察其萤光条带，如果有明显和特异性扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标
24、准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在0.1-0.5mM，一般经30个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条20BP 左右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。 引物设计相当重要，由于基因组有庞大数量的 DNA 序列，除了特异性的扩增外，往往很容易产生非特异性产物。如果引物与基因组存在较广泛的同源性，那么就会出现严重的非特异性扩弗，引物不仅与特异性的扩增区域结合，而且也与其它区域发生一系列非特异性结合，而选择引物时，常须考虑敏感性问题，特别是临床检验试剂盒，为了能把少至几个病原体检出，我们大都采用在病原
25、体基因组中重复出现的 DNA 序列设计引物，如果这些重复序列没有严格的同源性，就在可能出现不同长度的扩增产物而出现多条带扩增。 病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。 PCR 基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象
26、。诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟 PCR 是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解释或解决。想信随着对 PCR 的深入研究，在 PCR 的应用过程中不断总结经验，PCR 这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。PCR 反应的五要素1、引物引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用
27、为 20bp 左右。 引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 引物碱基： G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好
28、处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度 0.11umol 或 10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。2、酶目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3、dNTPdNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生
29、物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50200umol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 (偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 4、模板 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和
30、蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。 5、Mg2+浓度Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度为 1.52.0mmol/L 为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR 反应条件的选择
