1、K 原核生物的转录,K1 转录的基本原则 K2 大肠杆菌RNA聚合酶 K3 大肠杆菌s70启动子 K4 转录的起始、延伸与终止,K1 转录的基本原理： 转录概述：,转录是以双链DNA为模板，在ATP、UTP 、CTP、GTP四种核苷酸存在的条件下，由RNA聚合酶催化合成单链RNA的过程，其合成方向是 ： 53,编码链（coding strand）:与mRNA具有相同的序列，又称为有义链（ sense strand）. 反义链(antisense strand) ：合成RNA的模版链，又称为模板链 (template strand ).,起始,RNA 聚合酶结合到双链DNA上； 聚合酶在DNA
2、上滑动找到启动子； DNA 螺旋的解开 从起始位点开始合成, 该位点标为1。,转录单位 ：转录为单一RNA的一段DNA序列，起始于启动子 ，在终止子处结束终止子 启动子 ：是RNA聚合酶结合并发起RNA合成起始反应的一段DNA序列,延伸：,在RNA的3加入dNTP; RNA聚合酶沿着5 3 延伸新合成的RNA链， RNA聚合酶自身则沿着反义DNA链从3 5 前进。,终止：,转录复合物从模板链上分离，RNA从DNA上脱落下来； 终止发生在特异的一段DNA序列（终止子），经常发生在发夹结构上, 有些终止子需要rho 蛋白（因子）作为辅助因子才能起到终止作用，有些则不要rho 蛋白（因子） 的存在。
3、,E. coli 聚合酶: a 亚基,核心酶有两个相同的a亚基； a 亚基由 rpoA 基因编码； a 亚基对于全酶组装必须； a 亚基尚没有发现明确的转录功能， 但是对于启动子的识别很重要。,全酶 =核心酶+,亚基由 rpoB 基因编码, 为核心酶的成分； 亚基被认为是RNA聚合酶的催化中心： b亚基可能包含两个结构域，一个负责转录起始，一个负责转录延伸。,E. coli聚合酶: b亚基,E. coli 聚合酶: b 亚基,1. 由 rpoC 基因编码，为核心酶的组分. 2. 亚基 结合两个 Zn2+,两个 Zn2+ 可能参与了该 酶的催化中 心： b 亚基可能负责酶与模板DNA的结合 .,
4、s 因子 通过将核心酶对非特意性序列的亲和力的降低(104倍)，同时增加其对启动子的亲和力来帮助启动子的识别. 2. s 因子的结合将核心酶转变为全酶， s 因子在起始后当RNA链延伸到 8-9 nt时， s 因子会从全酶上释放下来。 3. 细胞内s 因子的数量只有核心酶的30。,E. coli 聚合酶: s 因子,2. 需要DNA模板的激活，尤其是双链DNA模板，其合成方向是 5 3；,RNA 聚合酶: 以DNA为模板合成RNA.,1. 合成RNA不需要引物；,3. RNA 的生物合成需要 Mg2+ 存在,4. 所有的RNA 聚合酶缺少 3 5 内切核酸酶活性, 合成插入碱基发生错误的频率一
5、般是1/104 to 105 个核苷酸；,细菌噬菌体T3 和 T7 RNA聚合酶就是单链的多肽,5. RNA 聚合酶一般是多亚基的酶，但是也不是一概而论.,6. RNA聚合酶随着不同的生物种类的不同有所区别,7. E. coli 还有依赖于单链DNA的RNA聚合酶，可以合成各种形式的 RNA.,启动子效率 : 是RNA聚合酶结合并起始转录的一段保守的DNA序列,1.转录起始位点为1 (position +1), 因而转录启动子的位置数为副值； 2.包含有对RNA聚合酶结合和起始转录的一段短的序列； 3.突变分析表明，只有很短的几个保守序列是启动子行使功能所必须的。,K3 The E. coli
6、 70 启动子,启动子大小：,1.70 启动子由 4060 bp的序列组成, -55 to +20 被聚合酶结合; 2.-20+20 区域在DNaseI消化时被强烈保护；3.突变分析表明，直至 40 的区域对启动子的功能是必须的； 4. 在-10 到 -35 区域间的的两个 6 bp 序列在E.coli启动子中尤为重要。,-10 序列,1.6 bp 的保守序列大概在 10 位置 (Pribnow, 1975)； 2. 共有的一致序列是： TATAAT； 3. 起始的两个碱基(TA) 和最后的碱基 T 在E.coli启动子中最保守； 4. 这个六碱基序列到转录起始点的碱基数为5 到 8 bp ，
7、尽管其间隔序列不重要但是碱基数（距离）重要； 5. 10序列是聚合酶启动DNA解旋的序列；,-35 序列 提高RNA聚合酶识别和与s 因子的相互作用的能力,1.35 位置附近的一段保守的六具体序列； 2. 一致序列为： TTGACA； 3.起始三个碱基 (TTG) 在 E. coli 启动子中最保守； 4. 在90%的E. coli 启动子中，与 10 序列间的距离为 16-18nt。,转录起始点,1. 在90%的基因中转录起始点为 嘌呤； 2.G 在转录起始点比 A更加常见； 3.通常, 在转录起始点的两侧是C 和 T 碱基 (i.e. CGT 或 CAT),转录起始点周围的序列影响转录的起
8、始：,启动子效率 (1),主要影响因素:不同启动子间的序列差异很大，转录的效率相差可以达到1000倍;-35序列组成增强与聚合酶因子相互识别和相互作用的识别区； -10 序列对于DNA的解旋很重要；起始位点附近的序列可以影响转录的起始.,启动子效率 (2)： 同时注意:,最初转录的30个碱基序列也影响转录： 该序列控制RNA聚合酶离开启动子，可以使另外一个聚合酶复合物重新起始转录，由此影响转录的速率甚至整个启动子的强度.DNA的负超螺旋可以增强转录的起始； 某些启动子的启动强度不够，需要辅助因子的激活：如 Lac 启动子 Plac 需要 cAMP 受体蛋白 (CRP )的 结合以增强转录的起始
9、。,K4 转录的起始、延伸和终止,与启动子 的结合,Promoter binding, 核心酶 (2 ) 对 DNA具有非特异性的结合能力 (松散结合但是稳定, 因子的加入，核心酶对非特异DNA的亲和力降低20000 倍 ). 因子使全酶结合到特异性启动子的能力增强100倍 RNA聚合酶通过滑动找到启动子序列，识别双链的35 和 10 序列，聚合酶和配对状态的启动子DNA形成闭合的复合物。,DNA 解旋：, 为使反义链实现碱基配对，DNA双螺旋必须被聚合酶解旋； 负超螺旋能够增强许多基因的转录 ，但是也有例外的，如：促旋酶则被负超螺旋抑制 ； DNA 的初始解螺旋导致DNA与聚合酶形成开放的复
10、合物，这一过程称为紧密结合；,RNA 链的延伸：, 不需要引物 ； 链以 GTP (more common) 或 ATP开始； 聚合酶最先掺入最初两个核苷酸； 最先的九个碱基依次加上，酶并不沿DNA移动，在这九个核苷酸的加入过程中，该链随时有流产的可能； 启动子清除的最短时间为1-2 秒 (a relatively long event),RNA 链的延伸：, RNA聚合酶释放出因子，形成聚合酶DNA新生RNA的三聚复合物 转录泡 (DNA的解链区, 17 bp) 可能和RNA聚合酶一起沿着DNA链向前移动，前端解旋，后端重新形成超螺旋； RNA的3 与反义的DNA形成杂交的双链 (约. 12
11、bp) ； E. coli RNA聚合酶向前移动的速率一般约为每秒 40 nt.,RNA 链的终止：, 终止: RNA 链的分离 DNA的重新超螺旋 RNA聚合酶的释放； 终止序列：终止信号，RNA发夹结构是常见的终止信号； 不是所有的发夹结构都可以有效终止转录, 此时需要辅助因子rho() 蛋白介导转录的终止。,RNA 发夹结构：,1. RNA 转录后自我配对形成的结构； 通常茎部富含G-C，利于碱基配对的稳定，进而使RNA聚合酶停止下来； 在发夹的后面通常有4个或一连串的U，使之与反义DNA链的配对作用减弱；,依赖于Rho-蛋白的终止：, 尽管RNA聚合酶可以在一连串的U残基的发夹处终止，
12、但是有的终止位点不形成强的发夹结构，必须有一种辅助因子即（Rho） 蛋白帮助终止； Rho 蛋白可结合到单链RNA的一段序列上； Rho 蛋白(六聚体)然后水解 ATP并沿着新生的RNA朝转录复合物的方向前进，促使RNA聚合酶终止转录。,终止子：转录复合物发生分离的一段DNA序列.,1: 不依赖于Rho protein (r) 的终止：(1) 自身互补形成一个茎环或者发夹结构；(2)形成茎环结构的后面，模板链上有一连串的A ，转录后在RNA上形成一连串的 Us； 2: 依赖于Rho protein (r) 的终止； 仅有一个弱的茎环或发夹二级结构。,依赖于Rho蛋白的终止： 在RNA的 3-短没有一连串的 U 碱 Rho 蛋白 结合到某一RNA结构上(72bp) ，并沿着新生的RNA朝着RNA聚合酶复合体前进，最后在Rho 蛋白 的帮助下，实现转录的终止。,RNA 聚合酶/转录和DNA聚合酶 /复制的比较：,
