1、选取日期细胞电融合仪ECM2001安装/操作手册选取日期目 录1 检查清点货物及安装2 技术规格3 操作细则4 产生杂交瘤的实验方法5 服务及保修6 附录：电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用选取日期第一节 检查清点货物及安装1. 拆封包装：ECM 2001 细胞电融合仪采用纸箱包装，收到货物后，请检查包装完好程度，如果有任何损伤请速与我公司联系。请小心地拆开包装，将仪器及附件取出，并依据合同清点货物内容及数量，如果有任何外观损伤或者货物与合同有差异，请速与我公司联系。请保留包装箱，以便满足将来一旦要运送该仪器的需求。2. 电源：该仪器采用 220V 电源，请确认您的电源为稳定的 220V。如
2、果电源不稳定的话，有可能对仪器造成严重损害！请确认您的电源严格接地，我们提供给您的电源线为三芯带地线电源。请不要改动该三芯电源线结构，否则有可能对仪器造成严重伤害！3. 安装：如果确认仪器包装无问题，且与合同相符，则可以进行安装。请将仪器安装在一个干燥，水平，常温环境中。尽量避免灰尘和化学药品对仪器的损害。仪器与其他物品的距离不少于 15 厘米，以保证仪器冷却的需求。将电源线等附件拆包装，待用，依据后续章节继续操作。第二节 技术规格1. 外观尺寸：宽：17高：11长：17.52. 重量：47 磅3. 电气规格：电源：220V，单相，7A 耐熔保险交流：频率固定在 1MHZ 电压： 0 75 V
3、 （从零到峰值）脉冲时间：0 99 秒直流：高电压模式（HV）电压： 10 3000 V （峰值）脉冲时间：1 99 毫秒低电压模式（LV）电压： 10 500 V （峰值）脉冲时间：1 99 毫秒0.01 0.99 毫秒脉冲次数：1 99选取日期4.前面板控制介绍：编号 名称 功能1 SET AC VOLTAGE 此旋钮用于设置交流电压（0-75V） 。调整的数值显示在左侧的显示屏上。2 AC DURATION SECONDS 此按钮用于设置自动模式下交流电被激活时间的长度。时间用“+”和“-”按钮设置，最大到 99 秒。3 POST FUSION AC SECONDS 此按钮用于设置自动模
4、式下脉冲施加后作用的时间。最大到 9 秒，使融合后的细胞聚集在一起。4 SELECT THE MODE 此旋钮用于选择电穿孔模式：HV 高压模式（10-3000 伏/1-99 微秒） ；LV 低压模式（10-500 伏 /0.01-0.99 毫秒） ；LV 低压模式（50-500 伏/1-99 毫秒） 。一旦模式选择好，相应的指示灯就会亮起。5 PULSE LENGTH 此按钮用于控制电穿孔/电融合方形脉冲的脉冲长度，设定选择用 Lower(+)和 Upper(-)按键。6 SET VOLTAGE 此旋钮用于调节脉冲电压。HV 高压模式下，电压显示单位为千伏，设定范围为10-3000 伏； L
5、V 低压模式下，设定范围为 10-500伏。顺时针旋转电压增加，逆时针旋转电压减小7 NUMBER OF PULSES 此按钮用于设定脉冲个数（1-99） 。 “+”和“-“ 按钮用来选择所需脉冲个数。每向融合池发送一个脉冲，黄灯就会亮一下，同时发出一声嘟嘟声8 WAIT 当仪器运行到一个循环结束时，出于安全原因放掉电容器中的所有电荷，此灯会亮。当此灯亮起的时候，绝对不能操作主机。9 AUTOMATIC START 按一下并释放此按钮，可根据预先设定的电压、脉冲长度、脉冲个数激发一个排列和电穿孔循环。选取日期10 REMOTE 此接口用于连接远程控制盒，可以远距离操作主机。11 NUMBER
6、OF REPEATS 此按钮用于设定重复循环次数，最多可达 9 次。12 MANUAL START 此双位置按钮允许手动控制 ECM 2001，第一次按下按钮，仪器开始工作，灯亮表示电压持续施加。第二次按出按钮，灯熄灭时，电融合电压被送到融合池上。13 PRINT SETTINGS 此按钮用来打印排列设置和电融合/电穿孔参数。如果使用 Enhancer 400 的话，请使用 Enhancer 400上的该功能按钮。第三节 操作细则1. 注意事项：请严格按照下述操作细则对 ECM 2001 进行操作。在没有连接打印机的情况下，严禁按“PRINT SETTINGS”按钮！否则仪器将会锁死。如果打开
7、仪器电源的时候，发现“MANUAL START”按钮处于亮灯状态，请马上关闭电源！2. 程序或步骤（操作过程）高电压警告：为了实际操作和安全的原因，在手动或自动操作模式中，ECM 2001 在施加交流电场或直流脉冲的过程中，请不要接触任何电缆或电极连接处，当需要连接或拆下电缆时，要检查系统不在操作中或处于备用状态。Automatic 自动操作模式：1. 连接 Chamber（融合池）和位于 ECM 2001 背面的输出插口。2. 如果使用打印机的话，把打印机电源电缆插到 ECM 2001 背面的打印电源接口上(J4)。3. 如果使用打印机的话，用串口线缆将打印机连接到 ECM 2001 背面的
8、打印机输入口上。4. 如果使用 Enhancer 400（示波器）的话，将 Enhancer 400 的电源线插在市电上。5. 如果使用 Enhancer 400（示波器）的话，先用电缆将 Enhancer 400 的输入插口与ECM2001 背面的输出插口连接，然后用电缆把融合池连接在 Enhancer 400 上的输出插口上。6. 把 ECM 2001 的电源线插到合适的电源插座上（220 伏） 。7. 打开 ECM 2001 背面上的电源开关。8. 设定所需的 AC Voltage (1) 即交流电压。9. 设定所需的 AC Duration Seconds (2) 即交流持续时间。10
9、.选择 HV 或 LV 模式(4)。11.设定 DC Pulse Length (5) 即直流脉冲长度。12.设定 DC Voltage(6) 即直流电压。13.设定 Number of Pulses (7) 即脉冲个数。14.设定 Post-Fusion AC Seconds (3) 即融合后交流时间到所需的脉冲长度。15.把细胞悬液/试剂倒入 BTX Chamber（融合池）中。16.检查所有的设置。17.按下 Automatic Start(9) 即自动按钮，ECM 2001 发出一声嘟嘟声，把预先设置的所有参数送到 Chamber（融合池）上。选取日期18.仅对电穿孔来讲，设置 AC
10、Voltage (1)、AC Duration (2)和 Post-Fusion AC (3) 为零，其余步骤不变。Manual 手动操作模式：1 其余步骤同 1-11，按一下 Manual Start(12) 即手动按钮，手动模式中，AC Duration (2) 即交流持续时间按钮不再起作用，持续施加交流电场。在显微 镜下观察 Chamber 中细胞，当细胞相互接近成二聚体时，再次按一下 Manual Start(12) 即手动按钮，结束交流场。ECM 2001 发送电穿孔脉冲。注意：交流电压的值不能在指示器上调节。3. 仪器设置： 与打印机的连接方式：1. 将 ECM 2001 的电源线
11、插在市电插线板上。 （220 伏）2. 把打印机电源电缆插到 ECM 2001 背面的打印电源接口上(J4)。3. 用串口线缆将打印机（501 型）连接到 ECM 2001 背面的打印机输入口上。4. 使用 5343 型连接电缆或者 464 型连接电缆（适用于 Microslide 450，450-1，450-2，450-3）或者 465 型连接电缆（适用于 Microslide 453，453-10）连接 ECM 2001与Microslides, 将连接电缆插入到 ECM 2001 背面的输出插口中。630B 安全操作池或者其他电极针的连接与此类似。选取日期与 Enhancer 400 的
12、连接方式：1. 仔细阅读 Enhancer 400 的使用手册。2. 将 ECM 2001 的电源线插在市电插线板上。 （220 伏）3. 将 Enhancer 400 的电源线插在市电插线板上。 （220 伏）4. 将红/黑高电压电缆两端分别依照颜色插入 ECM 2001 的相对应的输出和 Enhancer 400 的相对应的输入插口中。5. 连接电击设备。 （参见与打印机连接的第四步）4. 操作：自动操作1. 打开 ECM 2001 背面的电源开关。2. 设置所需的交流脉冲时间（2） 。3. 选择高压模式（HV）或低压模式（LV） （4） 。4. 设置直流脉冲长度（5） 。5. 设置直流电
13、压（6） 。6. 设置直流脉冲个数（7） 。7. 设置融合后所需的交流脉冲时间（3） 。8. 把细胞悬浮液/试剂倒入 BTX Chamber 中。9. 检查所有的设置。10. 按一下自动按钮（9）会发出一声嘟嘟声，ECM 2001 输送设置的所有参数 到融合槽中。11. 对于电穿孔，设置 AC Voltage (1)、AC Duration (2)和 Post-Fusion AC (3)为零，其余步骤不变。手动操作：1. 其余步骤同自动操作中的 1-9 步。2. 按一下 Manual Start(12) 即手动按钮（指示灯只亮 90 秒） 。手动模式中，AC Duration (2) 即交流持
14、续时间按钮不再起作用，持续施加交流电场。在倒置 显微镜下观察载玻片上的细胞时，可以变动 AC 幅值，以得到最优的排列选取日期（串）结果。3. 当细胞近似成串时，再次按一下手动按钮，撤掉交流电场，加上所设置的直 流参数。打印数据：1. 从 ECM 2001 打印输出，按打印按钮两次（2） 。2. 从 Enhancer 400 打印输出，按 Enhancer 400 上的打印按钮一次。5. 操作参数的选择：1. 排列参数：AC Voltage：设置交流电压。AC Pulse Length：设置脉冲长度。2. 电穿孔参数：选择高压模式（HV）或低压模式（LV） （4）Pulse Length ： 设
15、置直流脉冲长度。DC Voltage：设置直流电压。Number of Pulses：设置脉冲次数。3. 融合后交流参数：6. 显微镜和载玻片的使用用 464 连接电缆或 465 连接电缆连接载片与 ECM 2001 ，用 461 连接电缆连接 464 连接电缆或 465 连接电缆与 1269 同轴电缆接头连接。 。 。 。 。 。 。 （参见前述章节）选择 AC Voltage 使细胞缓慢向载片电极移动，建议用胶带固定同轴电缆在显微镜载物台上来防止电缆线过重使载波片移动。用微量移液吸头或注射器加入或吸出细胞悬液。选择 AC Voltage，使细胞向向载片电极缓慢移动。按 10%比率逐渐增加融
16、合电压和脉冲长度，使融合率增加。靠近电极的电场最强，融合首先在这里发生，如果电场太强，细胞会立即解体。如果细胞不移动和电压的增加导致培养基的沸腾，说明细胞溶液的作用象电解使用新鲜的甘露醇配置准备 0.3 M 甘露醇（0.2 微孔过滤） （ pH 7-7.3） ，用无菌 0.1 N NaOH 调节 pH。在融合前调节甘露醇的 pH。缓冲液在融合前程序 5.3.1 中说明。其它低分子量糖类如蔗糖和葡萄糖也已得到成功的应用。在显微镜下操作载玻片时，使用手动模式更有利。这样，只要排列已经成功立即停止 使用秒表测量所需的排列时间。当使用更大一些的融合池时，在自动模式中设定相同的或更长一点的时间。如果演示
17、给许多人，使用带有电视摄象机和显示器的显微镜。选取日期第四节 产生杂交瘤的实验方法本章节中的相关具体步骤请参照英文版说明书，以英文说明书为准！下面只是一种推荐的方法，每个研究者应根据不同的细胞密度、融合培养基和融合前和融合后的不同处理进行实验，并参考相关文献。Ohnishi 等(BTX 书目#218)和Ruzin(BTX 书目#183)成功描述了哺乳细胞的融合方案4.1 材料4.1.1 细胞4.1.2 融合液4.1.3 融合促进剂4.1.4 仪器及其他材料1 含 10%胎牛血清和 2mM/Lglutamine 的 RPMI1640 或 DMEM2 Trypsin blue 3 无菌 96 微孔
18、板4 无菌5 带 10和 40物镜的显微镜6 可选择：2 个冰槽，一个用于试剂7 8 放置 BTX 仪器的水平桌或实验台9 台式离心机10 无菌圆锥试管11 可用的高压灭菌锅4.2 融合用小鼠细胞的预处理4.3 融合程序最优融合参数的建立可能花费一些时间，并且对每种新的骨髓癌/淋巴细胞对都必须进行实验。融合通常在室温下进行，在融合过程中细胞悬浮液也可以放置冰上。此外，也可以在实际的操作过程中，使融合槽放置在冰槽上。融合前必须浓缩细胞，并且用非电解质溶液洗涤。4.3.1 使用标准的 0.3M 甘露醇（MANNITOL）的融合骨髓癌细胞和淋巴细胞以 1：4 的比率混合，混合液 1000rpm 离心
19、 6 分钟得到细胞沉淀，弃去上清液，加入无菌 0.3M 甘露醇（pH 7-7.3） 。细胞用无菌 0.3M 甘露醇洗涤 2 次，重新悬浮细胞使密度为 2106/ml 备用。细胞在0.3M 甘露醇只能保留 2 小时。因此，在实验中，准备数个细胞沉淀可能是必需的。4.3.2 使用葡萄糖（GLUCOSE）的融合也可选择其他的非电解质缓冲液如 0.3M 葡萄糖（pH 7-7.3）作为标准的 0.3M 甘露醇的替代，这种情况只需用糖类代替甘露醇，除非细胞可以在葡萄糖中保存 4 小时。4.3.3 融合促进剂（ELECTIVE）4.4 标准 0.3M 甘露醇、葡萄糖和相关糖类的融合后程序1融合后，在无菌条件
20、下用移液管小心的把细胞悬浮液从融合槽转移到无菌试管。加10（500）ml 含 10%胎牛血清和 2mM/Lglutamine 的 RPMI1640 或 DMEM，静置 15 分钟。2500rpm 离心 5 分钟，弃去上清液。小心的用培养基重新悬浮细胞，把细胞转移到 96 微孔板，使每孔有 2105 个细胞（0.2 ml/孔） 。检查所有的孔，确定有足够的培养基。337 5% CO2 中孵育过夜4第二天取出一半的培养基，并加入 HAT 培养基。在第 4、7、10 天，再取出一半的培养基，并加 HAT 培养基。也可以给细胞补充饲养层或其他的生长因子。5每天都检查 HAT 培养基的筛选情况。一旦观察
21、到克隆形成，就开始在膨大的第一时期提选取日期供 HAT 培养基。4.5 提高融合产物的产量的程序按以上方法准备好用于融合的细胞后，下面的程序有助于优化融合参数。这一点对于没有过去实验数据的融合的细胞系很重要。1.用 Microslide 确定仪器参数2.设置 AC Voltage (1)和 DC Voltage(6)为零3. 设置 AC Pulse Length (2)和 DC Pulse Length (5)零4.在电极间隙中加入细胞悬液5.增加 AC Voltage 为 10V6.按一下手动按钮（12） ，观察 30 秒。如果细胞没有移动，每次 10 V 逐渐增加交流电压（AC Volta
22、ge）直到看到细胞移动。7.如果看到加热或蒸干现象，就改变细胞悬浮液。8.若改变细胞悬液，关闭排列信号。第二次按一下手动按钮（12） （90 秒限制） 。只要红色的指示灯在亮着，信号就在作用中。9. AC 电压和脉冲时间要一直试验到在 10-20 秒内细胞形成二聚体的比率相当高。记录设置条件。10.设置 AC 脉冲时间在几分钟内都可观察到排列的值11.设置融合后 AC 脉冲时间（3）直到 9 秒，使细胞在电融合后保持成串。12.根据细胞的生活力优化系统参数。使用最早得到的基本参数设置和用修改的参数设置作数个实验组每个实验组的细胞在含 10%胎牛血清、次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷和2mM/Lglu
23、tamine 的 RPMI1640 或 DMEM 中培养 4 天。每天都用 trypan blue exclusion 检测部分培养细胞的活力。选择 4 天后细胞活力最高的那组参数设置。13.研究细胞活力的系统参数应按以下进行：每次按 20%的大小改变排列电压（Alignment Voltage）和脉冲时间。电压高要求时间短。14.按 20%逐步改变 DC 电压和脉冲时间。15.试验融合后 AC 脉冲时间时细胞在融合后仍在一起。4.6 植物原生质体的电融合程序以下的方案仅作为研究人员用植物原生质体进行遗传工程研究的一个指导。4.6.1 基本程序1.按常规程序分离得到新鲜的原生质体（注意：如果已
24、发生细胞壁再生，融合不会成功） 。2.小心的用移液管加入非电解质融合液3.弃去上清液，细胞重悬于非电解质融合液，根据细胞大小调节细胞密度为 1.5-6105 个/ml4.进行电融合。4.6.2 融合液一般地，非电解质融合液与融合前的溶液的渗透压、pH 和组成最相近时，得到的细胞生活力最高。1.可使用非电解质的糖如甘露醇、葡萄糖、山梨醇等。2 低盐浓度如 CaCl2(140M)或.Hepes 600M 为最优的选择，而且在一定时间内，对细胞并没有害。3.对每一类型的原生质体都应该研究其最适 pH。 pH 在 7.0-7.5 之间，融合最为成功。4.渗透压应该与分离原生质体的溶液相同。5.再钙化的
25、原生质体已经成为融合到一起。4.6.3 仪器设置典型的融合产率在使用 protease 时为 20%，不使用时为 7%；PEG 处理的融合率一般为选取日期1%。1.增加 1 个或 2 个脉冲似乎并不增加融合产量（频率） ，对原生质体却有损伤。2.用于 Microslide 的典型设置时间 排列（成串） 35V 25 秒电穿孔 260V 40 微秒产量 总融合率 8.6% 异核率 2.6%4.7.1 细胞不排列其余部分及 Protocol 请参见英文说明书。选取日期第五节 服务与保修获取服务：1. 保修期内的服务： 请置电服务维修部门，并将所发现的问题以文本的方式传真到维修部门； 依照维修部门的
26、建议，进行调节和观察； 如果问题仍未解决，请按照维修部门的通知，将仪器装箱回运到厂家维修部门进行专业维修。如果用户未经维修部门授权，自行将仪器进行解体维修，将失去保修权利！2. 保修期外的服务： 请置电服务维修部门，并将所发现的问题以文本的方式传真到维修部门； 依照维修部门的建议，进行调节和观察； 如果问题解决，将没有费用发生。 如果问题仍未解决，请按照维修部门的通知，将仪器装箱回运到厂家维修部门进行专业维修； 此时发生的费用，将至少包含运费，维修硬件所产生的元件费用。选取日期测试#测试表格 是 否1 确认电源线确实插牢，并电压为 220 伏。2 打开电源开关。仪表亮了吗？3 设置交流（1）和
27、直流（6）全为 0。4 设置 Select Mode 按钮（4）为 HV（高电压）模式 1-99usec。HV 模式的绿色指示灯亮了吗？5 设置 Select Mode 按钮（4）为 LV（低电压）模式 0.01-0.99msec。lV 模式的绿色指示灯亮了吗？6 设置 Select Mode 按钮（4）为 LV（低电压）模式 1-99msec。lV 模式的绿色指示灯亮了吗？7 按下 Manual Start 手动按钮。手动按钮灯亮了吗？8 再按一下 Manual Start 手动按钮。手动按钮灯灭了吗？9 在仪器上设置下列参数设置 AC Voltage（1）为 30 伏设置 AC durat
28、ions (2)为 03 秒设置 Post Fusion 为 03设置 Select Mode（4）为 HV 模式 1-99usec设置 Pulse length (5)为 40设置 DC Set Voltage (6)为 50 伏设置 the Number of Pulses (7)为 02按 the Automatic Start (8),并释放。SET AC 上的绿色指示灯亮了吗？如果以上问题中的答案有任何否出现，请与维修服务部门联系！选取日期附录：电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用郝新保 综述 (第四军医大学唐都医院 西安 710038)摘 要 电穿孔技术利用电场造成细胞膜的改变从而
29、将 DNA 导入细胞内，同时还可用于细胞融合以及动物克隆等。基因电转移的效率通常比化学法提高 1-2 个数量级，主要与脉冲波形、长度、缓冲液等有关。方波直流电脉冲应用广泛，在有关细胞核移植的多项研究报告中均指出其重要作用。关键词 基因转移，克隆，电穿孔中国图书资料分类法分类号 Q13过去十年中，关于基因功能的研究取得了丰硕的成果，并因此带动了基因工程、基因治疗以及单克隆抗体技术的进步，而在动物生殖生物学领域的革命性技术进步则导致了绵羊、牛、猴子和小鼠等多种动物的克隆成功。电穿孔技术和仪器的发展在这些成就中扮演了重要角色，使得人类不但能从胚胎细胞克隆动物，甚至能从完全分化的成熟细胞获得克隆动物。
30、全新的基因操作和生殖技术将为 21 世纪带来重要的科学成就。电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将 DNA 导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。1 在基因转移和杂交瘤中的应用1.1 动物和昆虫细胞转染电穿孔技术在 80 年代初期开始用来将 DNA 导入多种动物细胞 1，较之传统的磷酸钙和脂质体转染，电穿孔具有操作简便、转染效率高等诸多优点，特别是对那些其它方法难以奏效的细胞具有明显优势，但它的影响因素也比较多。电场强度：电压太低时，细胞膜的改变不足以允许 DN
31、A 分子通过，而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞细胞而言，250-2500V/cm 的电压可获得有效转染 2,3。电脉冲形状和长度：电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种，大多历时 20-100 毫秒。缓冲液：通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液，但有报道认为 HEPES 缓冲液的转染效率更高，血清也可以提高转染效率 4。其它诸如转染温度，DNA 浓度和构象等均会对转染效果产生影响。1.2 大肠杆菌和酵母的转化电穿孔法在 80 年代末开始被用于转化大肠杆菌 5，由于细菌相对较小，因此与 DNA 导入动物细胞相比，大肠杆菌通常要求 4000-20000V/cm 的脉冲强度才
32、能获得有效转染。化学法感受态细胞的转染效率最高只能达到每微克 DNA 106-108个转化体，而电穿孔法却可以达到 109-1010个转化体的水平，较前者提高 10-100 倍，因此在制备 cDNA 文库等要求较高转化率的工作中就显得十分关键。酵母菌电转化克服了乙酸锂和原生质体法烦琐和转化率低的不足，效率明显提高 6。1.3 细胞融合制备杂交瘤细胞融合主要用于产生杂交瘤细胞 7,8。在单克隆抗体的制备过程中，传统用 PEG 融合法产生杂交瘤细胞，这在现代化生产中存在许多局限性。而电融合法制备杂交瘤可以大选取日期规模地批量、高效融合，缩短了整个生产周期。除此以外，在细胞生物学研究中电融合还被广泛
33、应用于其它杂交细胞的制备 9。2 胚胎工程的核移植和活化在从简单的胚胎干细胞转染到核移植胚胎的电活化中，电穿孔技术都发挥了关键的作用，下面是一些重要的应用。2.1 单性生殖、四倍体及嵌合体2.1.1 单性生殖中的电活化反复的直流方波脉冲可以激活卵母细胞使其发生分裂而产生单倍体胚胎。可以通过细胞松弛素 B 抑制第二极体或通过电融合来获得二倍体细胞。2.1.2 四倍体胚胎的制备在胚胎的两细胞阶段应用直流脉冲可以导致细胞融合产生四倍体胚胎。这在小鼠和猪、牛都得到了应用 10。2.1.3 胚胎干细胞嵌合体的制备通过胚胎干细胞的电转染可以制备嵌合体转基因小鼠。将干细胞注入受体的胚泡，然后将这个胚泡转入代
34、理母亲子宫。生出的后代之间互相杂交产生纯合子可供用于生殖研究。已经制备了如小鼠、猪、兔和鳉的胚胎干细胞嵌合体 11。2.2 电融合在核移植技术中的应用1938 年当 Hans Spemann 提出核移植的设想时克隆技术已经初露端倪。首次在两栖类动物进行的克隆报道于 1952 年，但直到 1970 年青蛙才被克隆成功。核移植是目前多个物种生殖研究的热点技术。核移植克隆的目的是将被克隆生物的细胞核转移到宿主系统中来指导胚胎的发育并产下新的个体。首先将针插入去核卵母细胞的透明带，把供体细胞注入卵母细胞的卵黄周间隙。细胞融合仪提供的交流电使供体细胞和卵母细胞排列好，随后 1 到数个直流波使核移植胚胎被
35、激活而发生分裂。分裂产生的胚胎细胞被移植到代理母亲子宫妊娠直到生产。2.2.1 供体和受体细胞的电融合电融合首先使细胞膜融合，然后细胞变园成为一个细胞。影响融合的因素有：细胞排列、融合缓冲液、脉冲参数、电极形状和卵母细胞成熟程度等。融合过程的第一步是细胞排列。在这个过程中细胞被排成特定的方向使得发生融合的细胞膜与电场方向垂直。这个排列过程可以手工完成也可以用交流电场来控制，后者能够同时操作多个胚胎。融合缓冲液通常是些较低离子强度的溶液如浓度在 0.28-0.3M 之间的甘露醇、葡萄糖和蔗糖。10-100mM 的 Ca2+能增强融合效率 12。脉冲参数包括电场强度、脉冲时间和脉冲次数。在核移植的
36、卵母细胞融合时电场强度通常在 600V/cm 到 3.6kV/cm 之间，而脉冲时间多介于 30-250ms 之间。研究显示不同种类细胞需要的最佳参数各不相同。通常电场强度和脉冲时间呈反比关系，较强的电场可以弥补较短的脉冲时间 13。单个脉冲即可使细胞发生融合，有学者认为增加脉冲数能提高融合效率，但有的观点却相反。对电极的研究还不多，常用的是平行的柱状电极，间隙为 0.2-0.5mm.2.2.2 融合细胞的电刺激活化细胞活化常用不同时长的直流方波。核移植过程中的电刺激活化对细胞融合必不可少也十分有效。Collas 的研究显示成熟的卵母细胞活化效率比较高。活化效率与电场强度和脉冲时间无关，却与脉
37、冲波形有关。非均一的电场能得到较高的活化效率。最佳的电场强选取日期度依赖电极间隙。脉冲数以及脉冲之间的间隔增加都可提高活化效率 14。3 供核来源不同的核移植3.1 以胚胎为基础的核移植由核移植产生的哺乳动物胚胎克隆涉及 8-64 个细胞胚胎的其中一个细胞与去核的成熟卵母细胞之间的融合。Ilmense 和 Hoppe 于 1981 年首次报道了产生成活个体的核移植 15。他们的研究没有被重复出来，但却产生了效率更高的核移植技术 16。许多物种成功的核移植实验都使用了电融合技术。Li Meng 和 Don Wolf 把这一技术应用于灵长类于 1997 年发表了克隆恒河猴的实验研究结果 17。他们
38、的工作为基因治疗提供了有效的动物模型。3.2 以胚胎和初生动物细胞系为基础的核移植应用胚胎分裂球作为细胞核供体有许多限制。如何产生合适的胚胎细胞是个瓶颈，而且分离的分裂球难以在体外进行遗传操作，使得克隆之前无法有效地向其转移基因。因此许多学者从事发展基于胚胎或初生动物细胞系的核移植策略。1996 年位于苏格兰的 Ian Wilmut 研究小组报告他们利用细胞系获得转基因绵羊的结果 18。用于核移植的细胞系来自于胚胎，已经在体外培养了 6-13 代，在移植之前用血清饥饿法诱导其停止生长。1997 年利用转染人 IX 因子基因的绵羊羊胎纤维母细胞获得的核移植绵羊克隆获得成功 19。Cibelli,
39、 Stice and Robl 首次报告了使用永生化的胎牛纤维母细胞作为细胞核供体获得的克隆转基因奶牛。他们的工作首次证明活跃分裂的细胞在进行细胞核移植以后可以继续发育 20。3.3 以分化成熟细胞为基础的核移植应用细胞系的核移植研究为分化成熟细胞的克隆扫除了障碍。Ian Wilmut 于 1997 年报告了第一只来自分化成熟细胞的动物克隆-绵羊多利 21，这一成果震动了整个世界。为多利提供细胞核的是一只成年绵羊的乳腺上皮细胞，同样应用了血清饥饿诱导法处理细胞。此后不断有应用体细胞作为细胞核供体获得克隆动物的报告 22-24，证明了多利的技术路线确实是可行的。4 电穿孔设备的性能早期电穿孔设备
40、的波形和时间都是固定的，使用不便且效果差。20 年来的发展使得设备本身和附件的技术水平都有了很大提高。4.1 脉冲形状早期的指数衰减式脉冲一直沿用至今，保留在低端产品的设计上，主要用于基因转染。新开发的方波脉冲产品成为目前市场上的主流，在众多品牌中方波脉冲的纯度和重现性并不完全一致，应选择那些专业厂家的产品。有的产品用一系列高频脉冲代替方波，其导入基因和细胞融合的效率还有待于进一步证实。除了直流脉冲以外，有些用于细胞融合的设备还可以产生非正弦交流波使细胞按电场方向排列，可比单纯直流脉冲获得更高的融合效率。4.2 脉冲强度和时间由于细菌和细胞的操作需要不同的脉冲强度和时间，而低端产品的强度和时间
41、调整范围都比较窄，因此作用单一。通用型产品可以产生 0-3000V 的电压以及 1 微秒-10 秒的脉冲，因此可应用于细胞、细菌转基因和细胞融合、胚胎工程等多种操作。4.3外围设备带有监视器、打印机和遥控器接口的细胞操作系统已经出现，与这些设备配套使用能选取日期方便地记录和优化实验参数，可以在最短的时间内取得最佳结果。参考文献1 Neumann E, Schaefer-Ridder M, Wang Y, et al. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric field. EMBO J, 1
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