1、第三章 酶(Enzyme),酶的概述酶的化学本质酶的结构和功能酶的作用机制酶促反应速度及其影响因素酶活力的测定,本章讲授提纲,第一节 酶的概述,一、酶的概念,酶是生活细胞产生的具有高度专一性和催化功能的生物分子。,酶是一种生物催化剂。,大多数的酶都是蛋白质。,1、酶的定义,2、酶与普通催化剂的异同：,相同点：,少量酶催化大量反应；参加反应，但不消耗（理论上）。,不能引发热力学上不可进行的反应。（G0）,能加快化学反应的速度，不改变化学反应的平衡点(对正逆反应有相同的催化效果）。,降低活化能。,例： 2 H2O2 2H2O + O2,1mol 过氧化氢酶 6106 mol H2O2 1mol 离
2、子铁 610-4 mol H2O2,不同点：,高效性：酶的催化效率极高。是一般催化剂的1071013，是无催化剂的1081020倍。,专一性：具有高度的特异性。酶对其所作用的物质和反应有严格的要求。,酶活性可调节控制。,活细胞产生，不断进行自我更新。,酶对环境条件敏感,易失活。,酶要求的反应条件温和(常温,常压,pH7)。,1克-淀粉结晶酶在65条件下可催化2吨淀粉水解 淀粉酶只能催化淀粉的水解，蛋白酶只能催化蛋白质的水解，脂肪酶只能催化脂肪的水解；而一般的催化剂对其催化物质并无严格要求，如酸能催化淀粉、蛋白质、脂肪等物质水解。,二、酶的分类和命名：,（一）酶的分类： 根据酶催化反应的性质和转
3、移基团类型分成六大类：,在每一大类中，又根据不同的原则分成几个亚类，每个亚类再分成亚亚类。然后把属于这一亚亚类的酶按顺序排列，这样就把已知酶分门别类排成 酶表。每一种酶在酶表中的位置可用统一的编号表示，编号由4个数字组成，前面冠上 EC 符号。,（二）酶的命名：,1)根据催化底物命名。例：蛋白酶、淀粉酶。,2)根据催化反应的性质命名。例：转氨酶、脱羧酶、加氧酶等。,3)结合上述两个原则命名。例：乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶等。,4)在上述命名基础上加上酶的来源或其它特点。例：胃蛋白酶、碱性磷酸酯酶等。,A.习惯命名法,命名的一般原则:,命名的一般原则: 酶作用底物的化学名称、构型和催化反应的类型，最
4、后加一个酶字。,B.国际系统命名法,底物：ATP和D-葡萄糖。 反应的类型：磷酸基从ATP转移到葡萄糖分子上。,系统名：ATP ：D-葡萄糖磷酸基转移酶习惯名称:葡萄糖激酶,L-丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 +谷氨酸 系统名称:L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 习惯名称:谷丙转氨酶又如 L-乳酸NAD+ 丙酮酸 + NADH+ + H+ 系统名称: L-乳酸：NAD+ 氧化还原酶 （习惯名称：乳酸脱氢酶）,三、酶的专一性（特异性）,1、概念：一种酶只能作用于一种物质或结构近似的一类物质，催化其进行一定的反应，产生一定的产物。酶对底物的这种严格选择性叫酶的专一性。,2、类别：酶的种类繁多，专一性
5、程度也不同，可分为：,(1)结构专一性：,1）相对专一性,只对底物分子中键有选择性，而对键两端的基团没有要求。例：酯酶、二肽酶、淀粉酶。,不仅要求具有一定的化学键，且对键一侧基团有要求，而对另一侧基团没有要求。 例：胰蛋白酶、 -D-葡萄糖苷酶等。,2）绝对专一性：,例：脲酶只催化尿素水解，尿素的任何衍生物如：甲基尿素等都不起作用。,对底物要求高，只能催化一种底物，进行特定的反应。特异性程度高。,CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2,(2)立体异构专一性：,酶对立体异构体具有高度专一性。即酶只能催化立体异构体中的一种发生一定的化学反应。,例：延胡索酸酶,第二节 酶的化学本质,一、
6、绝大多数的酶是蛋白质,1、酶是蛋白质经历了长期争论, 绝大多数酶的化学本质是蛋白质。,19811982年，Thomas R.Cech在研究动物四膜虫rRNA前体加工为成熟rRNA时，发现其有催化活性，取名“核酶(Ribozyme)”。,2、核酶（有催化活性的核酸）：,RNase P由RNA(77%)和Pr (23%)两组分组成，催化E. coli tRNA前体5端成熟。单独的RNA组分也具有酶活性,但单独的Pr组分无活性,只起维持构象作用。说明该酶起催化作用的仅仅是RNA组分。,Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA,核酶的催化特点
7、：,1）核酶作用的底物主要是RNA，还有DNA、多糖以及氨基酸酯等。,2）核酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转核苷酰反应等。,3）核酶催化效率很低。,4）由于核酶本身是RNA，很容易被核糖核酸酶(RNase)水解所破坏。,二、酶的化学组成,1、简单蛋白酶和结合蛋白酶,酶蛋白和辅因子单独存在时均无活性，二者结合在一起才具活性。在酶促反应中，酶蛋白决定反应的专一性；辅助因子决定反应类型。,2、酶的辅因子：,三、酶的四级缔合,1、单体酶：单亚基酶，一条肽链的酶（只有单一的三级结构）。多为水解酶。,2、寡聚酶：由2个或2个以上亚基组成的酶。含相同或不同
8、亚基的寡聚酶。,3、多酶体系：在某一代谢过程中，由几个酶形成的反应体系。,4、多酶复合体：由几种酶缔合成的复合体。催化细胞代谢中的一个连续反应系列。,多酶体系（multienzyme system）,许多酶常常是在一个连续的反应链中起作用，即前一个反应的产物是后一个反应的底物。,多酶体系与中间物示意图,多酶体系与多酶复合体？,例：丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（E1）硫辛酰转乙酰基酶（E2）二氢硫辛酰脱氢酶（E3）。,多酶复合体示意图,多酶复合体是几个功能不同但却功能相关的酶组合在一起，有利于一系列反应连续进行，也便于机体对酶的调控。,第三节 酶的结构和功能,酶分子的结构是酶功能
9、的基础。酶是高分子物质，这样的大分子在催化反应时是否整个分子都起着同样的作用呢？,酶作用的底物很多是小分子物质，充其量也只能和酶分子中少数基团接触。即使底物是大分子物质，但由于酶和底物各自具有特定的三维构象，相互接触只能是酶分子中的一个小区域。,与酶催化作用直接相关的只是大分子内的一个小区域，这一区域叫活性部位。,一、活性部位和必需基团,1、活性部位（活性中心）：,定义：酶分子中直接和底物结合并与酶催化作用直接有关的部位。,活 性 部 位,酶活性部位的基团,2、必需基团：,酶分子中虽然有很多基团，但并非所有基团都和酶活性有关。,定义：酶分子中某些基团经化学修饰后，酶活性则丧失，这些基团称为必需
10、基团。,酶的必需基团,二、酶原的激活,有些酶合成后，即可自行形成特定的高级结构，也就表现出全部的酶活性。但有些酶最初合成的是无活性的前体。,1、酶原的定义：没有生物活性的酶的前体。 2、酶原激活的定义：酶原在一定条件下经适当的物质作用可转变成有活性的酶的过程称酶原的激活。 本质：实质上是酶活性部位形成或暴露的过程。,3、生物学意义：保护组织细胞；调节代谢。,胰蛋白酶原激活示意图,1、定义：催化相同的化学反应，但酶蛋白的分子组成、结构、理化性质及免疫学特性不同的一组酶叫同工酶。,三、同工酶,活性部位相同或相似：催化同一化学反应。 分子结构不同：理化性质和免疫学性质不同。,LDH由4个亚基构成的四
11、聚体。 LDH有两类亚基：肌肉型(M)和心肌型(H)。,例：乳酸脱氢酶（LDH）,不同组织中LDH同工酶的电泳图谱,同工酶虽然催化相同的反应，但可有不同的功能 ，如： 心肌中含量最多的是LDH1（H4），它对NAD+有较大的亲和力，易受丙酮酸抑制，它的作用主要是催化乳酸脱氢生成丙酮酸（正），有利于心肌利用乳酸氧化供能。 骨胳肌中含量多的LDH5，对NAD+亲和力低，不受丙酮酸的抑制，其作用是催化丙酮酸加氢生成乳酸（逆），有利于骨胳肌生成乳酸。,CH3CHOHCOOH+NAD+ CH3COCOOH+NADH+H+,四、别构酶,1、定义：能通过酶构象的改变使酶活性发生改变，从而对代谢起调节作用的酶
12、称别构酶。,2、结构特点：,寡聚酶（多亚基组成，MW大，结构复杂）,四级结构（亚基以特定的方式聚合）,有两个部位：活性部位；别构部位。,这两个部位可位于不同的亚基上：催化亚基和调节亚基; 也可以位于同一亚基的不同部位。,别构酶属于调节酶的一种。,3、别构效应（变构效应）：,定义：调节物（效应物）与酶分子中别构部位结合后（非共价），酶分子构象发生改变，使酶活性部位与底物的结合和催化作用受到影响，导致酶活性升高或降低，从而调节代谢过程，这种效应叫别构效应。,调节物(效应物、配基/体)：底物、产物或其它物质。,一、化学反应的速度和活化能：,在一个允许进行的反应中，任何反应物分子都有进行反应的可能，但
13、并非全部分子都能进行反应，只有活化分子的碰撞才能发生反应。,第四节 酶的作用机制,1、活化分子和活化能,活化分子：在一个反应体系中，含能量达到或超出某一阈值的分子叫活化分子。,特点：处于激活状态；含能量高；不稳定的、短暂的分子瞬间状态。,活化能：活化分子具有的能量比一般分子具有的平均能量高，高出的这部分能量叫活化能。,非催化过程和催化过程自由能的变化,2、提高反应速度的途径：增加活化分子数量,（1）供给能量(例:提高温度)。,（2）降低活化能。,3、酶和普通催化剂一样，通过降低活化能增加反应速度。,活化分子的数量越多，反应速度越快。,二、中间产物学说,1、内容：酶在催化某一化学反应时，首先酶与
14、底物结合，生成不稳定的中间产物，然后中间产物再分解出产物，并释放出酶来。,2、证明:关键是中间产物是否存在,证1. 酶与底物形成中间复合物用电镜、X-射线晶体结构分析直接观察到。,证2. 光谱法证明:POD和底物(H2O2)中间产物的存在。,POD是含铁卜啉的蛋白，具有特征性的吸收光谱。,POD在645nm, 583nm, 548nm和498nm有四条吸收带。向酶液中加入H2O2，光谱发生变化，原来四条带消失,显示出两带:561nm和530.5nm (E与H2O2发生作用) 。再加入另一底物AH2，两条带消失，又出现原来的四条带。,三、锁钥学说和诱导契合学说：,1、锁钥学说(lock and
15、key theory) ： 是Fischer于1894年提出的。,学说内容:酶活性部位的结构(比作锁孔)与底物的结构(比作钥匙)互相吻合，二者就像锁和钥匙的关系一样结合在一起。,锁钥学说,学说内容:酶的活性部位的构象是柔韧可变的。当底物与酶接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，构象发生改变，便于与底物嵌合成中间产物。,2、诱导契合学说(induced-fit theory) ：,是Koshland于1958年提出的。,酶与底物结合成中间产物后，通过什么方式催化反应进行，迅速得到产物？使酶具有高催化效率？,四、酶具有高催化效率的原因（P176）,1、邻近和定向效应 2、 “张力”和“形变” 3、广义的
16、酸碱催化 4、共价催化,1、邻近和定向效应（proximity and orientation effect）：,邻近效应：酶的活性部位与底物相互靠近，才能反应。化学反应速度与反应物浓度成正比，在反应系统的某一局部区域，底物浓度增高，则反应速度也随之提高。,定向效应：底物分子间以及与酶活性部位之间有严格的方向（空间排布）。,2、 “张力”和“形变” (strain and distortion)：,实质是酶诱导嵌合的动态反应。当底物与酶靠近时诱导酶的分子构象变化；变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变” ，从而促使ES ，进入过渡态。,3、广义的酸碱催化(acid-base c
17、atalysis) ：,酶分子上的一些基团作为质子供体或质子受体，对底物进行酸碱催化。在水溶液中这些广义的酸性基团或碱性基团对许多化学反应是有力的催化剂。,氨基酸 质子供体 质子受体 种 类 (酸催化基团) (碱催化基团),4、共价催化(covalent catalysis) ：,酶与底物生成不稳定的共价中间物，这一中间物易转变成过渡态分子，降低活化能，加速反应进行。,不同酶起主要作用因素不同，一般由其中某2种或2种以上因素作用的。,第五节 酶促反应速度及其影响因素,一、酶促反应速度的测定 化学反应进行的快慢是用化学反应速度表示。,1、测定酶促反应速度的方法：,2、酶促反应进程曲线：,酶促反应
18、开始后，在不同时间测定产物的量，以产物的生成量对时间作图，得出酶促反应进程曲线。,(1) 依据中间产物学说，讨论最简单反应。一底物、一产物、一中间产物的反应。,(2)其它条件保持恒定，并选择最适条件。,(3)初速度阶段。,说明：,二、影响酶促反应速度的因素：,1、酶浓度E：,前提：1）SE,S足以使所有的E形成ES。2）其它条件固定且在最适条件时。 v = kE,2、底物浓度S：,酶促反应速度随底物浓度而改变，呈矩形双曲线。,（1）底物浓度对酶促反应速度的影响：,S对酶促反应速度影响的三个阶段：,（2）米氏方程：,1913年，Michaelis和Menten根据中间产物学说进行了解释并推导出一
19、基本公式即米氏方程。（假设E和S迅速达到平衡，在平衡态下得出）。,1925年，Briggs-Haldanc,对推导做了修正，用稳态代替了平衡态。,根据中间产物学说，酶促反应分两步进行:,米氏方程的推导：,用米氏方程对S和V间的关系进行解释：,2) S足够大时，SKm，分母中的Km可忽略不计, 得: V= Vmax = K3Et 属于零级反应。,米氏方程:,（3）米氏常数：,1)定义:Km是酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。单位：mol/L 不同的酶Km值不同，一般10-310-5 mol/L。,酶的特征性物理常数。故可用Km鉴定酶。Km与E无关，而与E的性质和纯度、底物种类、缓冲液
20、的种类、浓度、 反应温度、时间等有关。,2)意义:, Km可近似地表示酶对底物的亲和力。,确定最适底物。如酶可催化多种S反应，则具有多个Km，其中Km值最小的是该酶的最适底物。,（4）Km和Vmax的确定,1) V对S作图,2) 双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法）,将米氏方程改写成:,当1/S=0, 1/V= 1/Vmax,当1/V =0, 1/S =1/Km,3、温度（T）：,酶促反应同其它化学反应一样，受温度影响较大。,在040范围内, 随着T上升，V上升，活化分子增多；T最适温度时，T上升V下降，E变性失活。温度对V的影响是以上两种作用的综合效应，表现为钟形曲线。,最适
21、温度:,定义：一定条件下，酶在某一温度时，活力最大，这一温度叫最适温度。,最适温度不是酶特征性常数，受测定条件限制。如作用时间长短和底物种类等影响。,最适温度一般在3540。,酶对环境pH非常敏感。每一种酶只能在一定pH范围内表现酶活性，超出这个范围，酶即失活。,pH对酶促反应速度的影响类似温度对V的影响，也表现为钟形曲线。,4、pH值,最适pH：酶催化活性最高时溶液的pH值。, 每种酶都有自己的最适pH，一般在pH48，人体内大多数酶的最适pH在6.58.0。, 酶的最适pH不是酶的特征性常数。,由于酶受pH的影响很大，因此酶的提纯和测活，通常在一定的pH缓冲液中进行。,5、激活剂（acti
22、vator）,概念：凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂。 如无机离子、有机分子等。,激活剂对酶的作用有选择性。一种激活剂对一种酶起激活作用，对另一种酶可能起抑制作用。,3)有些蛋白质大分子:蛋白酶为酶原激活的激活剂。如：肠激酶对胰蛋白酶原的激活。,激活剂的类型：,2）有机分子：,.某些还原剂： Cys-SH、GSH、Vc等可作为硫基酶的激活剂（例：木瓜蛋白酶、GLP脱氢酶） .金属螯合剂：EDTA能除去重金属离子也可视为酶的激活剂。,如Mg+是多种激酶和合成酶的激活剂； 动物唾液中的-淀粉酶则受Cl-的激活； 被氧化的巯基酶当加入维生素C、半胱氨酸、GSH等还原剂时酶的活性恢复或活性提高。,6
23、、抑制剂（inhibitor，I） ：,概念：凡是与酶的必需基团结合使酶的化学性质改变，从而使酶活力降低甚至完全丧失的物质称抑制剂。抑制剂的这种作用称抑制作用。,变性作用：是酶高级结构破坏，活力丧失。,变性作用：是酶高级结构破坏，活力丧失。,(1)不可逆抑制,定义：I与E以共价键结合，且是不可逆的过程，不能用透析、超滤等方法除去I使E恢复活力，这种作用叫不可逆抑制。结合部位是必需基团。,E + I EI,例: DFP（DIFP）对胆碱酯酶、胰凝乳蛋白酶的抑制。,E-OH + 青霉素（I） EI复合物 （糖肽转肽酶，参与细菌细胞壁合成的酶）重金属（高浓度时使酶变性）、碘乙酸、碘乙酰胺 、对-氯汞
24、苯甲酸对巯基酶的不可逆抑制。酶-CH2SH + ICH2-CO-NH2 酶-CH2-S-CH2-CO-NH2 + HI酶-CH2-S-CH2-CO-NH2 + Cys 酶-CH2SH + Cys-CO-NH2,酶失活,酶复活,(2) 可逆抑制(reversible inhibition) ：,抑制剂以非共价键与酶结合，是可逆的过程，用透析的方法可以除去抑制剂使酶恢复原活力。,竞争性抑制作用 (competitive inhibition) ：,1）定义:I和S相互竞争性地与E结合，但I与E结合后就妨碍了S与E的结合，因而E活力下降。这种抑制作用叫竞争性抑制。,3、举例: 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的
25、抑制作用,还有如草酸COOH-COOH、戊二酸COOH-(CH2)3-COOH、草酰乙酸COOH-CO-CH2-COOH等都与琥珀酸结构相似，均可作为此酶的竞争性抑制剂。,磺胺药物的抑菌作用,对氨基苯甲酸,对氨基苯磺酰胺 SMZ,二氢叶酸合成酶E,叶酸（FH4是嘌呤核苷酸合成的辅酶）,I,4、动力学特征：,EI + S 不反应,取方程的倒数，进行双倒数作图 ：,Km变大，增大1+I/Ki倍，Vmax不变； 斜率增大。,非竞争性抑制作用(noncompetitive inhibition),1）I与S可以同时结合于酶的不同部位，I与E结合后，不妨碍E进一步与S结合，但所形成的E、S、I三元复合物
26、不能发生反应，这种抑制作用叫非竞争性抑制作用。,2）特点：,I的化学结构与S的分子结构不相似。,S和I分别与酶的不同部位结合。,抑制作用的强弱取决于I，与S无关。所以当I一定时，不能通过增大S减弱抑制。,实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金属络合剂（EDTA、F-、CN-）,3）动力学特征：,Km不变，Vmax减小(1+I/Ki倍)。,取方程的倒数，进行双倒数作图 ：,Km不变，Vmax减小,减小 1+I/Ki 倍。 斜率增大。,第六节 酶活力的测定,检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力来
27、表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。,一、酶活力的测定,酶活力测定实际上是反应速度的测定。,二、酶活力的表示方法,酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit, U）,国际单位（IU）: 1moL变化量 / 分钟Katal（Kat）：1moL变化量 / 秒 习惯单位（U）: 底物(或产物)变化量 / 单位时间,国际单位(IU):以最适条件或某一固定条件下，1 min催化1mol底物转化为产物所需要的酶量为一个酶活力单位（IU），即：1 IU = 1mol / min,Katal单位：指最适条件下，每秒钟转化1 mol底物所需要的
28、酶量，即：1 Kat = 1 mol/s,1 Kat = 6107 IU 1 IU = 16.6710-9 Kat,1）在最适条件下，1h水解1g淀粉的酶量为淀粉酶的一个U。,2）在最适条件下，1min生成1g酪氨酸的酶量为蛋白酶的一个U。,习惯单位：,在实际使用中，人们根据结果测定和应用都比较方便、直观，又规定了酶的活力单位，但不同酶有各自的规定，如：,酶的比活力度量酶的纯度。,三、酶的比活力（specific activity，也称比活性）,酶的比活力：指1mg蛋白（氮）所具有的酶活力单位数。,酶的制备及应用(自学),酶在生物界普遍存在。可从动、植物及微生物等各种原料中提取。目前工业上大多
29、采用微生物发酵法来获得大量的酶制剂。 酶的分离提取、纯化实际上就是蛋白质的分离纯化。 1、抽提：组织匀浆或细胞破碎，缓冲液提取，离心除渣。 2、分离纯化之一：粗分级，除去大量杂质。 3、分离纯化之二：细分级，得到较纯的酶。,酶与医学的关系（自学）,一、酶与疾病的发生 有的疾病的发病机制直接或间接与酶的异常或酶活受抑制有关。酪氨酸酶缺乏引起白化病；苯丙氨酸羟化酶缺乏产生苯酮酸尿症；急性胰腺炎与胰蛋白酶原在胰腺中被激活有关。 激素代谢障碍或维生素缺乏可引起某些酶的异常。如VK缺乏 酶活受到抑制多见于中毒性疾病。如有机磷农药中毒、重金属盐中毒。,二、酶与疾病的诊断,某些组织器官受到损伤造成细胞破坏或
30、细胞通透性增加，细胞内的某些酶可大量释放入血。如急性胰腺炎时血清和尿中的淀粉酶活性升高；急性肝炎或心肌炎时血清转氨酶活性升高。 细胞的转换率增高或细胞的增殖增快，其特异的标志酶可释放入血。如前列腺癌病人可有大量酸性磷酸酶释放入血液。 酶的合成或诱导增强。如胆管堵塞时胆汁的反流可诱导肝合成大量的碱性磷酸酶；巴比妥盐类或酒精可诱导肝中的谷氨酰转移酶生成增多。,三、 酶与疾病的治疗,许多药物可通过抑制生物体内的某些酶来达到治疗的目的。如磺胺类药物，青霉素，氨甲喋呤等等。,酶与一般催化剂的异同；酶的化学本质；酶的结构和功能的关系；酶反应动力学；单体酶、寡聚酶、多酶复合体、别构酶、酶原、酶原激活、同工酶等概念。,从结构上与一般蛋白质的共同点去理解酶的理化性质；从不同点去理解酶的特异性、催化作用和催化机理。,结合酶的化学本质和催化机制学习各种影响酶反应速度的因素。,本 章 小 结,
