1、第九章 基因治疗(gene therapy),基因治疗是通过一定的方式，将野生型基因或有 治疗作用的DNA序列导入人体靶细胞来纠正或改 善人类的遗传缺陷。 早期基因治疗的概念比较局限，仅指遗传缺陷基 因的修复，主要用于单基因遗传病的治疗。 现在基因治疗的概念：凡是采用分子生物学的方 法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都 可称为基因治疗。如对癌症、多基因病、传染性 疾病、心血管疾病等的治疗。,1972年T.Friedmann 和R. Roblin在Science上发表了题为“基因治疗人类的遗传病（Gene therapy for human geneticdisease）”的文章。但鉴于体
2、外重组技术刚刚问世，人们对“基因治疗”尚感到远不可及，因而未得到学术界的认可。,直到1989年美国NIH的R.M.Blase和W.F.Anderson提 出的“基因治疗重症联合免疫缺损（SCID）”临床方 案得到批准，并于1990年，他们用腺苷酸脱氨酶 (ADA)基因治疗了一例ADA基因缺陷导致SCID的4岁 女孩Evans，这是世界上第一例基因治疗临床试验， 2年后Evans血液内T细胞的数量接近正常水平，且 ADA基因表达良好，随之世界各国都掀起了研究基 因治疗的热潮，很多遗传病患者都满怀信心地接受 基因治疗。R.M.Blase和W.F.Anderson也被公认为是 基因治疗的先驱。,不幸
3、的是1999年美国发生了格尔辛基（J. Gelsinger） 基因治疗副反应事件，美国当即下令暂停所有基因治 疗的临床试验。无独有偶，法国也发生了导致患者死 亡的“泡泡男孩（bubble boy） ”事件，法国政府也立 即终止了该项试验。使基因治疗骤然陷入了困境。经过多年的沉寂后，随着分子生物学的飞速发展， 细胞重编程等很多新技术的建立，特别是 2007年日 本的山中伸弥等成功地将皮肤细胞诱导成多能干细胞 后，又点燃了人们对基因治疗所寄予的新期盼,第一节基因治疗的策略,一体细胞基因治疗的策略 基因治疗可分为两大类: 生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy) 体细胞基因治
4、疗(somatic cell gene therapy)生殖 细胞基因治疗是将目的基因转入生殖细胞系中。不 仅纠正患者的遗传缺陷，而且患者的生殖细胞也带 有被校正的基因型。对于小鼠等动物，是可以通过 转基因进行生殖细胞系的治疗。,(a) 受精卵的注射,(b) 胚系的基因治疗,(c) 体细胞的基因治疗,转基因,转基因细胞,转基因注入受精卵中,转基因注入囊胚腔,嵌合小鼠,嵌合性腺,转基因克隆,体细胞基因治疗这种方法试图通过载体，将目的基 因转入某些患者的体细胞中来纠正异常表型。 目前，目的基因不可能转入身体所有的体细胞内。遗传病是由于致病基因在一些特定组织中表达的结 果。通过从有缺陷基因型的患者体
5、中取出某些细胞，将 克隆的野生型基因导入到这些细胞中，再将转基因 的细胞转入患者体内，为患者提供正常的基因功能。,体细胞基因治疗的策略：,（1）原位基因修复（in situ gene correction）：将致病基因的突变位点加以矫正，使致症状得到完全恢复。 （2）基因置换(gene replacement) ：用外源野生型基因原位替换病变细胞内的致病基因，来纠正突变基因的功能，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。 （3）基因激活(gene activation) ：有些正常基因不能表达并非发生了基因突变，而是由于被错误地甲基化或编码区组蛋白去乙酰化所致；也有的是编码区正常，但调控区发生了突变
6、，如启动子的突变使基因也无法表达。前者可以通过去甲基化或乙酰化使基因恢复活性；后者可以加入正常启动子来激活基因。,(4) 基因增效(gene augmentation)：将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。 (5) 基因干扰 ：也称基因失活，有两种干扰方法： 抑制有害基因：导入抑癌基因（TSG)来抑制癌基因的异常表达，但不能恢复癌基因的正常功能； 封闭有害基因：用反义RNA或小分子抑制RNA(siRNA)来封闭癌基因基因，同样不能恢复癌基因的正常功能，但可用来抑制病原体的关键基因。 (6) 免疫调节：将抗体、抗原或细胞因子的基因导
7、入患者体内，改变患者免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。 (7) 药物敏感疗法：应用药物敏感基因转染肿瘤细胞，以提高其对药物的敏感性。,二、基因治疗的关键步骤基因治疗的关键包括以下三个方面： 目的基因的选择； 靶细胞的选择； 选择安全而高效的方法和载体系统； 用于基因治疗的基因需满足以下几点; 在体内仅有少量的表达就可显著改善症状； 该基因的过度表达不会对机体造成危害； 外源野生型目的基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达； 具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。,三、基因治疗的靶细胞选择,目前基因治疗中尚不能使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞。选择靶细胞须考虑：最好为
8、组织特异性细胞；细胞易获得，具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月至几年；离体细胞较易受外源基因转化；细胞坚固，能耐受处理，回植到体内易成活。目前常用的靶细胞有：造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞等。,四、体细胞基因治疗的途径,目前体细胞基因治疗的策略可分为两种： （1）间接体内法，即先体外后体内(ex vivo)的方法 （2）直接体内（in vivo）法。先体外后体内就是将靶细胞由患者体内取出，于 体外完成基因转移后再回输到患者体内，此种方法 的优点为靶细胞明确、转染效率高；直接体内是将目的基因插入载体，经修饰后直接 注
9、入患者某特定组织中。此方法转染效率低，但较 前者简便、费用低，对于某些疾病，如重症联合免 疫缺陷病(SCID)的基因治疗效果是较好的。,（一） 体外基因治疗 或ex vivo基因治疗：,（1）从患者体内取出带有缺陷基因的细 胞，并培养； （2）将带有目的基因的载体通过转染或感染转移，到培养的靶细胞中，进行遗传修正； （3）对遗传修正的细胞进行选择和培养； （4）处理过的细胞用融合或移植的方法转入患者体内。,体内基因治疗,成纤维细胞,体细胞,先体外后体内基因治疗,（二） 体内基因治疗,将具有治疗功能的基因直接转入病人某特定组织中。 （1）利用反转录病毒载体时，要求靶细胞处在分裂期，但许多需进行基
10、因治疗的组织多处于静止期。 （2）目前用温和病毒载体（腺病毒和单纯性疱疹病毒）直接注入相应的组织。,第二节 基因转移的方法,基因转运的方法目前已有多种，总的可分为非生物方法和病毒方法两大类。前者包括裸露DNA直接注射、多价阳离子-DNA复合物转化，电转化，脂质体共转化和受体介导的转化等。后者指通过携带目的基因的病毒感染靶细胞并表达出目的基因的方法。,一、基因转移的非生物方法,理化方法介导的基因转移（非病毒载体）是目前发展较快的新型载体系统，其优点是低毒和低免疫反应。其携带的外源基因的载 体常独立存在细胞质中，不整合到宿主基因 组中。非病毒载体一般不受基因插入片断大 小的限制，还有使用简单、获得
11、方便、便于 保存和检测等特点。目前常用的方法有以下 几种：,（一）磷酸钙共沉淀法,当将氯化钙，DNA和PBS（phosphate-buffered saline）缓慢混合时，即形成磷酸钙微沉淀。如 有培养细胞（须先用氯化钙处理）存在时，DNA- 磷酸钙沉淀物能附着在细胞膜上，经过内吞作用 而进入细胞中。,（二）脂质体介导转染,将磷脂，胆固醇或其他脂类的乙醚溶液注入60 DNA水溶液中。乙醚在60 时气化蒸发，其速度达 到2ml/h时即形成单层或双层的脂质体小泡，其直径 0.20.5m，它将DNA包裹在其中。带有正电荷的脂 质体-DNA复合体很容易和培养基上的细胞融合，使 DNA分子进入细胞内。
12、这种简单的技术由Philip Felgner等建立的。,（三）电穿孔法,真核细胞的电穿孔是将细胞重悬浮于含有一定浓度 的DNA（约0.1 mg/ml）的N-2- 羟乙基哌嗪- N -2-乙 磺酸（ HEPES，N-2-hydroxyethylpiperazine-N -2- ethanesulfonate)缓冲盐溶液中。然后将此悬浮细胞- DNA放到一个特殊的电穿孔小槽中，小槽设有正、 负电极与电源相连接。,（四） 直接注射法：,(1)将含有外源DNA的溶液直接注入肌肉 或 甲状腺等可引起邻近的细胞摄入DNA和目的 基因表达的产物。 (2)重组DNA 可贮存于530的蔗糖溶 液中，也可溶在生理
13、盐水或PBS（磷酸缓冲 液）中以备注射。,（五） 微粒子轰击法：,用高能微粒子轰击，将外源DNA导入培养细 胞或活的哺乳动物组织内，在贴壁细胞、 悬浮细胞、活体组织中均能很好表达。亚 微粒的钨和金能自发吸附DNA。用这种方法 基因可在多种组织中表达。,（六）受体介导的基因转移,质粒DNA和某种特异配体之间形成复合体， 而这种配体能被特定细胞的表面受体所识 别。使外源基因可在活体内导向特定的细 胞、组织或器官。但用受体介导时所形成 的内吞小泡通常要被送到溶酶体中，可使 此小泡的内溶物被降解。然而通过完整的 腺病毒诱导小泡破裂，可使内含的DNA序列 保持完整，使其表达的绝对量显著提高。,一般采用配
14、体多聚赖氨酸（PLDNA）的 策略，如用脱唾液酸蛋白（asialoglyco- protein，ASGP）作为配体与PL连接可将反义 RNA带到肝中，这是因为肝细胞上有ASGP相 应的受体。,受体介导方法的优点： （1）是无感染能力； （2）可特异性转染靶细胞； （3）理论上不受DNA大小的限制； （4）构建灵活。缺点： （1）转染效率低； （2）难以用于体内基因治疗； （3）可能有免疫原性； （4）只有短暂表达。,二、基因转移的病毒方法,多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解RNA病毒能整合到染色体上；其基因表达水平较高等。目前已被用作载体的病毒有：反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单
15、纯性疱疹病毒和肝炎病毒等。,（一）反转录病毒载体,1反转录病毒(retrovirus) 属于正链RNA病毒，特点是： （1）可感染分裂细胞； （2）可整合到宿主染色体中； （3）表达时间较长。最广泛使用的又是Moloney鼠白血病病毒 （Mo-MLV）。,反转录病毒基因组大约10kb，含有三个最重 要的基因：gag（编码核心蛋白）、pol（编 码反转录酶）和env（编码病毒外膜蛋白）。 两端存在LTR 用于介导病毒的整合。,LTR gag pol env LTR,反转录病毒载体的优点是： （1）基因组小并且简单，能稳定地整合到宿主基因组的随机位点上； （2）能高效地感染宿主细胞，可将遗传信息传
16、递给大量受体细胞，细胞感染率可达100； （3）侵染范围广，可侵染不同生物和细胞； （4）原病毒较稳定，且拷贝数低； （5）对宿主细胞无毒副作用； （6）可包装10kb外源DNA。,缺点是： （1）仅整合到处于分裂状态的细胞； （2）一些反转录病毒中存在原癌基因，其会引起癌变的发生； （3）反转录病毒的LTR可致使细胞癌变； （4）常常只有短暂表达； （5）病毒滴度低（107pfu/ml）；插入容量有限，不能插入较大的基因。,2构建重组反转录病毒载体,构建反转录病毒载体多来源于鼠白血病病毒（Mo- MLV），此类病毒为嗜双性病毒，既可感染鼠细胞 亦可感染人细胞。 反转录病毒载体的基本成份包括：
17、 （1）病毒基因组分，如LTR、病毒的包装识别信号、翻译所需的剪接识别位点及poly（A）尾等； （2）高效的治疗基因如抑癌基因、自杀基因等： （3）标记基因，用于筛选； （4）其它质粒必要成分，如复制起始区。,反转录病毒用作载体时需进行几步改造： （1）基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因。 （2）制备包装细胞系，为载体DNA提供其丧失的功能。 （3）将载体DNA导入包装细胞系以产生病毒载体。 （4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。,gag,+,LTR,pol,env,LTR,人类基因,+,LTR,LTR,neor,5,5,3,3,用一个或多个外源基因来置换病毒基因
18、组中的gag,pol和 env 基因。此病毒载体能以不同的方式插入到细胞的染色体中。在此例中,用供选择的标记基因（neor）置换了病毒的gag 和pol 基因，而用一个人类的基因置换了env 基因。,5-LTR LTR-3, gag pol env, 包装细胞系,RNA, -,RNA 基因组,编码病毒蛋白的RNA,病毒蛋白,不产生 病毒颗粒,gag,LTR,pol,env,LTR,5,3,助病毒插入到培养的细胞中,细胞质,细胞核,用非生物学方法或转 染技术将重组DNA 插入到培养的包装细 胞系中，由于载体提 供了包装信号 + ， 载体的RNA基因组 能被包装。细胞内的 助病毒中所合成的衣 壳蛋
19、白自动包装成病 毒颗粒，然后被包装 细胞释放出来。但载 体病毒只能感染，而 不能再产生病毒颗 粒，因为它没有gag、 pol和env基因。,用载体病毒感染靶细胞(如人类的骨髓细胞)，载体病毒整合到靶细胞DNA中，形成前病毒。其基因随着基因组一道转录，整合的目的基因合成特定的蛋白质。,反转录病毒载体可分为以下几类： 双表达载体：在载体中插入两个外源基因分别取代gag ， pol和 env。外源基因的表达受到5LTR调控序列的控制。 内部启动子载体（IP vector）：在载体中插入两个外源基因，由5LTR调控； 自失活载体（pSIN）：前两种载体的LTR作为启动子有可能激活原癌基因。同时5LTR
20、启动子和外源基因的启动子可能会相互影响。为了克服以上缺点，人们构建了自失活载体。即删除5LTR启动子，这样反转录时破坏了两端的LTR区的模板，消除了LTR的潜在致癌作用。,反转录表达载体提供了一个基因转移有效方法， 使克隆基因在适当的宿主细胞中得到表达。通过脂 质体介导，用重组的+反转录载体稳定转染- 包 装细胞系能建立非复制的重组体反转录病毒库。重 组体反转录载体基因组的转录产生感染病毒的产物， 通过细胞膜释放到培养基中。恢复高滴度重组体反 转录病毒库被用来感染宿主靶细胞，在细胞内重组 体RNA基因组通过含在病毒衣壳中的反转录酶反转 录成双链cDNA。反转录病毒的表达系统能被用来进 行DNA
21、的转移和稳定转染 。,（二）腺病毒（Adv）载体,腺病毒载体中腺病毒基因组上的E1A（使原代细胞 永生化）和E1B基因（导致全面转化）已被目的基 因所取代，因而在体内普通细胞中缺乏复制能力； 仅在染色体上已整合有E1A和E1B的包装细胞（如 293细胞）中，复制缺陷型的重组腺病毒才能包装 成完整的腺病毒颗粒。,最优化的腺病毒载体的特点。图示腺病毒载体含有包装序列和ITR以及最低限度的腺病毒基因的组序列。,腺病毒生物学特性：,腺病毒DNA是36kb线性分子，两端各有一个 50bp反向末端重复区（ITR），ITR 内侧为病 毒包装信号。基因组上分布着四个早期转录区 （E1、E2、E3、E4），和一
22、个晚期转录区 （负责结构蛋白的编码）。重复序列（103 162bp)，其中含有复制起点和包装信号。E2， E4区编码复制蛋白；E3区和细胞免疫有关。,腺病毒载体的制备,（1）先构建含有E1(负责包装)或E3（和细胞免疫有关）区两侧序列的质粒； （2）将外源基因插入E1或E3区，并保持转录方向一致； （3）与腺病毒基因组中也含有E1或E3区某一侧序列的片断共转染细胞，在细胞中通过重组后挑取空斑，得到重组载体。,E1区,E1区,第一个DNA分子(即所谓穿梭载体，shuttle vector) 含有腺病毒左侧的反向末端重复序列（LITR） 、 腺病毒包装信号()等顺式作用元件以及目的基因 表达盒和腺
23、病毒基因组的左端一段序列；另一个 DNA分子（即骨架载体，backbone vector）与第一 个DNA分子的3端略微重叠，然后继续向右，包 含有大部分的病毒基因组序列。两种DNA分子共转 染入可以表达腺病毒E1区蛋白的细胞（如293、911 以及PERC6等），并发生同源重组，即可得到预期 的复制缺陷型重组腺病毒。,腺病毒载体优点：,（1）易于制备、培养、纯化和浓缩； （2）基因组大，因而可插入大片段外源基因 ； （3）可高效地（体外实验通常接近100%转导效率）转导不同类型的人组织细胞； （4）可转导非分裂细胞； （5）在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量； （6）进入细胞内并不整合到宿
24、主细胞基因组，仅瞬间表达，因而安全性较高； （7）可在呼吸道和肠道中繁殖，因此不仅可通过静脉注射进行基因治疗，而且还可以通过口服、喷雾、气管滴注等简单易行的方法进行基因治疗。,缺点：,（1）表达外源基因时间短，不能满足基因治疗的需要。如需长期表达需反复注射。（2）免疫原性强，可引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应；（3）重组、纯化费时；（4）几乎可以感染所有细胞，而缺乏特异性。,第一代腺病毒载体为E1或E3基因缺失，缺失区插入外源治疗基因。但此类型载体可引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，且表达外源基因时间短。 第二代腺病毒载体则另外让E2a或E4基因缺失，则产生较弱的免疫反应，其载体容量和
25、安全性方面亦改进许多。 第三代腺病毒载体缺失了全部的（无内容病毒载体，gutless viral vector）或大部分腺病毒基因（微型腺病毒载体，mini-Ad），仅保留ITR和包装信号序列。最大可插入35kb的基因，病毒蛋白表达引起的细胞免疫反应进一步减少；,（三）腺伴随病毒载体,腺伴随病毒（adeno associated virus，AAV）属细小病毒科，这类病毒的颗粒中含有正链或负链DNA,来自不同病毒颗粒的正、负单链DNA在试管内可形成双DNA结构。AAV的复制需要辅助病毒的参与，例如腺病毒或单纯疱疹病毒等。,腺伴随病毒的基因组中，DNA的5端和3端各有一个由145nt反向末端重复
26、序列（ITR）可形成发夹结构。 ITR对病毒的复制、基因的整合、病毒颗粒包装和病毒DNA从宿主细胞的切出等过程都具有重要的调控作用。,生物学特点: 此类病毒基因组很小，如2型腺相关病毒是由40 681 个nt 的单链 DNA组成；包含3个因：lip基因（木质素 过氧化物酶）、rep基因（编码负责调节病毒复制等） 和cap基因（编码衣壳蛋白）。 构建AAV载体时将病毒的基因组序列插入到质粒载体 中，将外源基因和调控元件取代这三个基因。为了避 免载体与辅助质粒重组而产生野生型病毒，人们改进 了辅助质粒，将AAV全部基因都置于ITR的控制之 下，这样只会产生重组的AAV，不会产生野生型AAV。,AAV载体的优点是：基因组小而易于操作。大部分基因可被替代而保留感染能力；感染谱广，可以有效地导入脑、骨骼肌、肝脏等许多类型的细胞中。可感染分裂和非分裂细胞；当助辅病毒不存在时，AAV能整合到宿主细胞基因组的特定区域；其ITR中无启动子和增强子，可避免激活原癌基 因；免疫原性弱，毒性很小，无致病性，安全性好；热稳定性好。而助病毒可在60下被灭活。,AAV的缺点是： 亦可能出现免疫排斥反应； 构建的载体实际应用时则很难达到靶向整合； 装载容量小（4.7kb）； 缺少高效的包装细胞，制备过程复杂，制备滴度低（104病毒颗粒/ml）。,
