1、1蛋白纯化陈虹亮总结Sunday, November 25, 200721.我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了 GST 亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。 请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用 GST 做亲和层析，但效率只有 5060左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用 0.5CHAPS 助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。 既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直接加 2%的 PEG 这样也
2、降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这样的蛋白是用 10%的乙醇加 3-5%的 PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液 PH 值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。 2)请问楼主有没有合成过配体为 FMN 的亲和胶？ 我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼
3、脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有 3-10 碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。 不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。 我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定，配基脱落少。我觉得是不错的选择。 包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的
4、办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件. 层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。 3)Sephadex G-25（medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐浓度限度如何？ 大家别客气，除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如
5、 1-2M 应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样品，我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。 4)我的蛋白 17kd 左右，能跟肝素亲和，一般用离子交换和亲和层析纯化， 现在我用聚乙二醇修饰它 ，分子量增加 5000 左右，修饰率不可能达到 100，请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开？（当然修饰后还残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉） 他们大多用凝胶过滤，我觉得这也不错的做法，毕竟 PEG 是链状的分子，在柱子上和普通蛋白行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白选择 sephadex G50 试试，它的范围在 1000-30000，应该是不错的选择。此外
6、PEG 是个疏水性的链，修饰后的蛋白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，3可以用这个原理分离。离子交换也可以选择，因为同样道理，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理，你可以试试，你手头的亲和能不能分开，你在这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。 5)我是个新手，谢谢楼主给我解决了许多难题。 我有个问题困绕很久，从细菌中提取酶，好象用常规的方法（超声波破壁，缓冲液提取） ，总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强，需要加助溶剂才能提取出来？另外，我是不是也可以加点甘油或者 PEG 来提取？ 其实这个问题我觉得是这样的，既然你是
7、提取那肯定是有沉淀和上清，你的目标蛋白的分子量你是应该知道的，那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里，剩下的问题你再解决如何提取。 对于不同的酶要看酶稳定如何，你可以用不同的 PH 去提取，我曾经提取一个酶用水就是提取不出来，需要用盐才能提取出来，多试试，设计个方案，这样才能解决问题，所以不一定加甘油就管用，你还得注意破碎本身会不会有问题，倒回去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继续探讨。 6)HPLC 是用来分析检测 or 分离纯化？ 如果可以用来纯化，上样量那么小有什么意义呢？ 如果是用来分析检测，怎样指导以后的分离纯化工作呢？ HPLC 既可以做分析也可以做制备，纯化上样量小，这样分离
8、效果好，就可能得到很纯的物质，同时配合质谱等就何以得到很多单一蛋白的特性包括序列等，这些纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。HPLC 重现性好,定量准确,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具. 分析出来后如果这个物质很稳定，直接线性放大就可以做大规模的制备，因此摸好了分析的条件也就相应有了制备的条件。7)利用蔬水性质，用反向 HPLC 方法分离的原理？（包括洗脱液的选择和谁先被洗脱下来等） ，请chromatography 兄详细点。反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择
9、主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。疏水的填料疏水集团密度只是反相的 10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具. 8)求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD 左右，4 对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？
10、我用过离子交换柱，纯度可以达到 60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教!这是我的电泳图谱，第 8 条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的 pET-3C 的载体，BL21 表达你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对 4 对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试：）至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫 71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B 不知道现在还有没有这个填料，你
11、可以问 pHarmacia 公司的人。你 pM 给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前4说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。9)我想用一个短肽（5 肽）作配基亲和纯化一个可与它特异性结合的蛋白（67kda） ，用什么填料比较好，您有什么好的见意？谢谢对于小分子的配基我觉得需要有一定的亲和手臂，否则
12、由于位阻很难有很好的分离效果，说到活化填料的选择我多说几句，大多人都会选择溴化氰，但是这样做的介质一般杂吸附多，此外没有亲和手臂，所以对于小分子的配基有时候纯化效果不好，此外本身对介质也没有交联作用，所以刚性也差，如果经常用极端 pH 洗脱配基脱落也多，这是它的一些缺点。环氧活化的琼脂糖凝胶可以有很多的手臂选择，刚性也好，没有非特异吸附，形成的键比别的活化方法更稳定，因此合成的亲和介质性能更出色，你可以选择这样的方法，偶联很简单，你 pM 你的邮件给我，我可以把一些材料发给你，供你参考。10)我目前作的一个蛋白药物的分子量大约是 7000， 等电点 4，目前要去除内毒素有何简单可行的方法？（此
13、蛋白已经纯化好，但检验内毒素不过关）你用过分子筛吗？superdexG75 对你这种蛋白比较合适。做之前请先用 1MNaOH 1ml/min 平衡 2 小时。这种方法除内毒素，非常有效。如果问题请与我联系。，我们以前去除都是用去内毒素亲和的填料直接加到样品中震荡 40 小时左右,就可以,可以做到 122)我纯化的蛋白等电点预测为 8.04 左右,我用 ph6.5 的mM 磷酸钠，mM 的缓冲液，柱的填料为钎维素，上样后我用缓冲液洗柱以去掉没有结合的蛋白，不幸的是目的蛋白也被洗了下来，接下来的梯度洗脱根本就无用请帮我看看是哪儿除了问提！把缓冲液 pH 调低点，到 5 左右，样品要的盐浓度和 pH
14、 都不能高于你平衡缓冲液的浓度。123)请问 sephadex G-25 和 QAE-sephadex A-25 使用,再生的方法.我要分离分子量 700 左右的物质,使用那种填料啊(用于工业化生产)都可以用 0.5MNaOH 洗 3 个柱床体积,再用 50%乙醇洗,然后保存在 20%的乙醇中.700 左右的物质是什么东西,也许只能用 RP-HPLC 了124)我的蛋白，从包涵体中纯化，用 SKL 溶解复性后上 Sephadex G100 柱没问题，用 PEG20000 浓缩后再上 DEAESephadex A50 后不论用多大的 NaCl 浓度都挂在顶上下不来。都是在 10 度以下过的柱子，
15、温度和缓冲系统都不成问题，是什么原因呢？吐血 ing 也许是没有复性好,总之我怀疑是沉淀在柱子上了,你用变性剂洗试试.或者是你蛋白不稳定,沉淀在柱子28上,所以洗不下来. 我的蛋白的确很不稳定，但是在这样的温度和操作强度下应该不是沉淀变性。另外，我是用 SKL 溶解包涵体后透析除 SKL 复性，用非变性 PAGE 检验过的，如果再用变性剂洗涤的话前面的工作不是白做了吗？我尝试把柱子顶上的粘着蛋白的珠子再用 SKL 处理，丙酮沉淀后 SDSPAGE 发现目的蛋白就在里面，真郁闷呢 所以这说明你蛋白溶解性不好,你复性后的缓冲液应该和你上离子交换的一样,这样才不会沉淀,此外你可以用离子交换的缓冲液去
16、稀释你的样品再上样,避免因为缓冲液不同而沉淀,此外你的蛋白是不是疏水性比较强,加点甘油或乙醇看能不能增加溶解性,此外要注意 pH,这些原因都会影响你蛋白的溶解性.125)用离子交换分离蛋白质或多糖以往多用弱的离子交换树脂，现在出现了许多强离子交换树脂，如 Q Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow，资料上介绍这些埴料性能较好。请问楼主，是否我买了Q Sepharose Fast Flow 一般就不用买 DEAE Sepharose 等弱阴离子填料？谢谢。我觉得 Q 可以部分代替 DEAE. 126)求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD 左右，4 对
17、二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以达到 60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教!这是我的电泳图谱，第 8 条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的 pET-3C 的载体，BL21 表达你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对 4 对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试.至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫 71-7105-00 Thiopro
18、pyl Sepharose 6B 不知道现在还有没有这个填料，你可以问 pHarmacia 公司的人。你 pM 给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。请问什么是分级沉淀包涵体？ 参考这个帖子吧:http:/ 小时，对脱盐仅 30 分钟；适用于大规模纯化的最后步骤
19、，在纯化过程的任何阶段均可进行脱盐处理，尤其适用于两种缓冲液交替时。白蛋白最好用蓝色琼脂糖凝胶纯化,很好用,我们都用它专门去除白蛋白,你需要我可以把材料发给你,至于 IgG 可以用重组蛋白 A 琼脂糖凝胶一步纯化,很好用,当然你也可以考虑用疏水去纯化.白蛋白也可以用镍琼脂糖凝胶柱去纯化. 139)请问：sephadex 系列, superdex 系列 的 gel fitrition column 有什么不同？ 前者是葡聚糖凝胶,后者是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合的凝胶,所以前者刚性差,不容易做高分辨率的小颗粒,而后面的可以,刚性好,不容易因为 pH,盐,压力而体积有很大的变化. 140)请问上
20、HPLC 的样品盐浓度过高是否影响纯化效果？ 那倒不会,但是盐浓度高和有机溶剂混合也许会产生沉淀堵柱子,所以还是要很小心,最好别有高盐 141)柱子一般寿命多久，保养好了能用四五年吗？每次上样量是否不得超过十分之一？用于装填柱子的 reservoir 在哪里买得到，中文名叫什么，不同规格柱子用的 reservoir 是否是一个规格？一般过一个柱洗脱液的流速控制在多少，大概需要洗脱液多少个柱体积，需要多长时间？ 除了凝胶过滤需要严格装柱子,需要装柱器,别的柱子都不用,至于上样量也只有凝胶过滤也上样的体积有关,别的色谱都不需要遵守,一般是根据载量来上样,于体积关系不大,洗脱也看你挂东西的多少,一般 3 个柱床体积,多的要 5 个柱床体积,时间多少看你的流速和你的柱床体积.
