1、RACE 技术RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过 PCR 进行 cDNA 末端快速克隆的技术，通过PCR 技术实现的，无须建立 cDNA 文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE 是基于 PCR 技术基础上由已知的一段 cDNA 片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的 3端和 5端的方法。主要分类一般分 5-和 3-RACE 两种。3-RACE 较简单，首先将 mRNA 或总 RNA 用 PolyT 引物反转录，根据一般基因具有 polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计) 和 PolyT 引物 PCR 即可。大多实验者反映一次
2、 PCR 可以搞定。5-RACE 相对较难，目前流行几种 5-RACE。其一为加接头(传统) ，根据接头引物和自己设计特异引物 PCR，可以设计 巢式 PCR 二次扩增。另外，有利用反向 PCR 技术，连接成环在 PCR。还有，GENE 公司一种 smartRACEPCR，利用反转酶末断加 C 特点,直接加上多G 接头，转换模板而无需用连接酶加接头。发展历史经典的 RACE 技术是由 Frohman 等(1988)发明的一项技术，主要通过 RT-PCR 技术由已知部分 cDNA 序列来得到完整的 cDNA5和 3端，包括单边 PCR 和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技
3、术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman 等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespalova 等，1998：Matz 等 1999)。对传统 RACE 技术的改进主要是引物设计及 RT-PCR 技术的改进：改进之一是利用锁定引物(lockdockingprimer)合成第一链 cDNA,即在 oligo(dT)引物的 3端引入 两个简并的核苷酸【5-Oligo(dT)16_30MN-3,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在 poly(A)尾的起始点，从而 消除了在合成第一条 cDNA 链时oligo(dT)与 poly(A)尾的任何部位的结合
4、所带来的影响；改进之二是在 5端加尾时，采用 poly(C)，而不是 poly(A)；改进之三是采用 RNaseH 一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热 DNA 聚合酶可能在高温 h(60 度-70 度)有效地逆转录 mRNA，从而消除了 5端由于高 CC 含量导致的 mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动 PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高 PCR 反应的特异性。随着 RACE 技术日益完善，目前己有商业化 RACE 技术产品推出，如 CLONTECH的 MarathoTM 技术和 SMARTTMRACE 技术术。邢
5、桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进 行 RACE 反应，结果发现使用 MarathonTM 所得到的片断总是比采用SMARTsupTMRACE 试剂盒到所得到的片断短。其原因在于 MarathonTM 技术反转录反应往往不能真正达到 mRNA 的 5末端。所以认为，进行 RACE 反应应当优选 SMARTTMRACE 试剂盒。引物设计基因特异性引物（GSPs）应该是：1、2328nt2、5070GC3、 Tm 值65 度，Tm 值70 度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5和 3RACE 反应的基因特异性引物（ GSP1 和 GSP2).由于两个引物的存在，PCR 的产物
6、是特异性的。4、cDNA 的合成起始于 polyA+RNA。如果使用其它的基因组 DNA 或总 RNA，背景会很高。5、RACEPCR 的效率还取决于总的 mRNA 中目的 mRNA 的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。6、在进行 5和 3RACEPCR 的时候应该使用热启动。7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为 PCR 反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。8、引物 GSP 中的 GC 含量要在 5070之间。这样可以使用降落 PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与 AP1 互补的引物，尤其是
7、在 3末端。9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1 和 GSp2 之间至少是 100200 碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。10、降落 PCR 可以明显的增加 RACEPCR 产物的特异性。在最开始的循环中， 退火温度高于 AP1 引物的 Tm 值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1 的温度，可以进行随后的 PCR 循环。11、验证基因特异性引物的对照：单个引物的阴性对照：只用一个引物 GSP 来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。利用两个 GSPS 进行阳性对照：
8、（只有两个 GSP 可以产生重叠的时候才可以采用此步。 ）为了确定 RNA 样品中目的基因确实表达，利用两个 GSP 和接头连接的 cDNA 来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复 cDNA 的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行 cDNA 的合成。12、制备和抽提 polyA+RNA 不要使用 DEPC 处理过的水。纯化完 mRNA 之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测 mRNA 的质量。哺乳动物的 mRNA 样品是 0.512kb 的拖带，在其中有4.5 和 1.9kb 的 rRNA 的条带。非哺乳动物的 mRNA 应略小。比较与优化目的：研究环化法、
9、末端脱氧核糖核酸转移酶法和 SMART 反转录酶法 3 种常用 5RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。方法：以播娘蒿 RNA 为模板，先按文献标准方法进行 5RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。结 果：未优化前环化法和 TdT 酶法条带几乎不可见，SMART 反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT 酶法胜之，但条带 依旧弥散，而SMART 反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论 SMART5RACE 效果最好，其次为TdT 酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化 条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中 5RACE 方法
10、的选择提供了 依据。实验步骤cDNA 第一条链的合成：我们建议进行 cDNA 合成的对照反应，这样可以对样品的 cDNA 的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中 42 度保温一个小时。注意：在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。cDNA 第二链的合成：第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH 和连接酶。T4DNA 聚合酶的功能是补平dscDNA 的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的 mRNA。1、建议进行阳性对照,cDNA 的质量取决于制备的 polyA+RNA 的质量。非哺乳动物样
11、品的mRNA 大约在 0.53kb 之间。2、通过电泳检测 cDNA 的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA 进行稀释。3、按照程序进行连接反应。4、如果没有对比样品和对照的产量，利用 TricineEDTAbuffer 制备接头连接的 dscDNA的 1/50 和 1/250 的稀释物，用两种稀释物进行 RACEPCR 反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。PCR 扩增进行 5和 3的 RACEPCR 扩增。利用以下的程序进行降落 PCR 反应：94 度 30 秒5 个循环：（1）94 度 5 秒（2）72 度 4 分5 个循环：（1）94 度 5 秒（2）70
12、 度 4 分钟2025 个循环：（1）94 度 5 秒（2）68 度 4 分钟注意：我们建议使用降落 PCR 反应，这就要求 GSP 的 Tm 值70 度。1、当循环结束时，利用 1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物 5l，使用适当的分子量 marker。2、可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在 68 度多加 5 个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在25kb 的时候，经常使用 4min，0.2-2kb 的时候将延伸时间减到 23min ，对于 510kb的条带，延伸时间增加到 10min。产物验证1、应该对 RACE 的
13、片段进行验证 ,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。2、有 3 种验证 RACE 产物的方法：（1）比较由 GSP 和 NGSP 获得 RACE 产物。（2）Southernblot（3）克隆并测序3、建议最好测得 RACE 产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。比较由 GSP 和NGSP 获得 RACE 产物。4、对于 5末端的 RACE 产物，比较由 AP1 和 GSP1 扩增出来的产物和由 AP1 和 NGSP1扩增出来的产物。5、对于 3末端的 RACE 产物，比较由 AP1 和 GSP2 扩增出来的产物和由 AP
14、1 和 NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个 PCR 的特异性产物是非常有用的。6、如果条带是正确的，在嵌套 PCR 反应中的条带应该是略微小一些。基本 PCR 和嵌套PCR 产物的迁移率的不同取决于 cDNA 结构中 GSP1 和嵌套引物的位置。克隆和测序1、可以利用胶回收试剂盒来回收 RACE 产物，此试剂盒适合回收 2.5kb 以下的 RACE 产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用 TricineEDTAbuffer30l 重新悬浮 DNA 样品。2、电泳 5l 回收的样品来鉴定回收的质量。3、将回收的 PCR 产物直接克
15、隆到 /A 型的 PCR 克隆载体 中。另外还可以利用接头和/ 或cDNA 合成引物中的 Not1、Srf1、Xma1 、ECOR1 等酶切位点，将产物克隆到常规载体中。4、对于 5端的 RACE 产物，我们建议挑取至少 810 个不同的克隆以获得 5端的最大可能性的序列。 （反转录并不总是进行到 mRNA 模板的 5末端，尤其是长模板。另外，T4DNA 聚合酶会移走 5末端的 020 个碱基。 ）5、一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括 5和 3的非翻译区。cDNA 的获得通过部分或全部测序鉴定了 RACE 产物后，可以通过两种选择
16、获得全长的cDNA。通过 PCR 和克隆的方法。通过 PCR 的方法获得全长 cDNA：1、扩增长的 cDNA 需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。2、根据从 5和 3RACE 产物获得序列信息设计 5和 3GSP 引物。这些引物应该来自 cDNA 的 3或者 5的末端，应该是 2328nt 长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计 3和 5的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行 PCR 反应。3、进行如下的热循环：94 度 30 秒25 个循环：（1）94 度 5 秒（2）72 度 215 分钟4、延伸的时间应
17、该等于预期的 cDNA 长度加上 2 分钟。例如：预期得到 6kb 的条带，用 628 分钟的延伸时间。注意：如果没有条带或者条带弱，增加 5个循环；或者优化 PCR 的条件。5、在 1.2%的琼脂糖凝胶上分析 5l 的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的 cDNA。6、制备 1.2%的 TAEbuffer 制备琼脂糖凝胶。不使用 TBEbuffer，TBE 的胶很难制备全长的 cDNA。7、将剩下的 45l 反应物点样，选用适当的 marker。8、利用长波紫外观察 cDNA（300nm）切下全长的 cDNA。注意：应该尽量减少紫外对 cDNA 的照射。9、利用
18、胶回收试剂盒回收 cDNA。此试剂盒适合回收 2.5kb 以下的 RACE 产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用 TricineEDTAbuffer30l 重新悬浮 DNA 样品。10、将全长的 cDNA 克隆到 T/A 型的 PCR 克隆载体中。通过克隆产生全长的 cDNA：1、如果你已经获得了含有重叠部分的 5和 3RACE 产物，同时在 cDNA 的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的 cDNA。2、利用酶切获得的 3和 5扩增产物，并且利用 T4DNA 连接酶将它们连接起来。利用接头和 cDNA 合成引物中的内切酶将最终的全长 cDNA 克隆到载体中。3、在哺乳动物基因组中，NOT1 和 Srf1 酶切非常稀少，大约 106bp 才出现一次，因此在绝大多数的 cDNA 中是不出现的。
