1、真核生物组织 DNA的提取,Total DNA extraction from eukaryotic tissue,实验目的,了解真核生物基因组DNA提取的一般原理通过植物组织DNA的提取，掌握真核生物组织中DNA提取的方法和步骤,高等动物、植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有个碱基对。某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；基因组相对完整断裂的基因组以便用于以后分析，RFLP分析，基因文库
2、的构建，基因探测等的研究。真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出。,DNA提取原则,保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染,实验原理,植物细胞内各种DNA（包括基因组DNA和核外DNA）称为总DNA。高等植物的DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。目前从样品中分离DNA的方法主要有两种，分为CTAB法和SDS法（型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜
3、蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来）。十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl triethylammonium bromiade, CTAB) 是一种阳离子去污剂，可以有效的裂解植物细胞壁，且与DNA形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时DNA又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离。,SDS（十二烷基硫酸钠 ）是阴离子表面活性剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA 抑制DNA 酶的活性。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉
4、淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。,SDS法提取植物组织DNA,DNA含量和纯度的检测,DNA的吸收光谱峰在260 nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50 g/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280 nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。,试剂,提取缓冲液：100 mmol/L
5、TrisCl (pH8.0), 20mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl, 1.5% SDS 24：1的氯仿：异戊醇 预冷无水乙醇,SDS抽提液配方(1000ml):,操作步骤,叶片0.5g左右, 剪碎, 置研钵中，加入1mL提取缓冲液， 研磨成浆；吸入10mL EP管中，剧烈摇动混匀； 60水浴保温30-60min，不时颠倒混匀； 室温下3000rpm离心10min； 小心吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇，剧烈震动； 室温下3000rpm离心10min； 小心将中间层吸入新的离心管中； 加入1倍体积预冷95%乙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 8000rpm离心5min ，弃掉上清； 75酒精洗一次，晾干沉淀； 加入5L RNaseA（10g/L）, 37 10min, 除去RNA。 加50-100l水融解，-20贮存。,结果分析与讨论,
