1、艾滋病病毒学与致病机理基础入门问答 1、 及时发现并鉴定 HIV 各种亚型有何重要意义？A、追踪流行趋势B、开发有效的检测试剂和疫苗C、研制有效的临床治疗药物2、HIV 对下列环境中的哪些物理因素和化学因素抵抗力较弱？A、高温B、酒精C、紫外线通常人们对一种疾病的认识总是从症状开始，依据类推比较的原则和体内外反复实验研究，最后明确导致这种疾病的病因。艾滋病也不例外，人们在发现艾滋病病人数年后分离出艾滋病病毒(HIV)，二十余年后的今天，HIV 是引起艾滋病的病原体已成为一个不争的事实。艾滋病(AIDS)目前虽然没有治愈的方法，但已经可以通过特异性抗病毒治疗改善病人症状，延长生命，降低发病率和死
2、亡率。第一节 艾滋病病毒的分类一、艾滋病病毒“家族”从病毒“大家族 ”分类来说，HIV 属于逆转录病毒科。HIV 在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。HIV 自身的家族成员包括 HIV-1 和 HIV-2。HIV-1 分为 M、O、N 亚型组。M 亚型组包括A、A2、B、C 、D、E、F1 、F2、G、H、J、K 亚型。O 亚型和 N 亚型很少见。HIV-2 主要局限于西部非洲和西欧，北美也有少量报告。HIV-2 有 A、B、C 、D、E、F、C 亚型，它的生物学特性与 HIV-1 相似，但毒力较弱，感染导致的病程较长，症状较轻。及时发现并鉴定 HIV 各种亚
3、型对于追踪流行趋势，准确做出诊断，开发新的药物筛选方法和有效的检测试剂和疫苗，研制有效的临床治疗药物均具有重要意义。在我国流行的毒株主要是 HIV-1，HIV-2 仅有个别报道。1999 年在福建和上海发现并证实我国有 HIV-2 感染者，在华中、华南和西北几个省区也有血清学证据提示可能存在 HIV-2 感染者。我国 HIV-1 流行株的分布见表 2-1。 二、艾滋病病毒的结构、功能及其临床意义(一)病毒颗粒HIV 呈球形，直径约 100120nm。典型的 HIV-1 颗粒由核心和包膜两部分组成，核心包括病毒 RNA、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类。HW 的 RNA 为两条相同拷贝的正股
4、RNA 链。病毒复制必须的酶类有 3种，分别是逆转录酶(p66，p51)、整合酶(p32)和蛋白酶(p11)。核酸外面为病毒衣壳蛋白(p24，p17)。病毒的最外层为包膜，其中嵌有 gp120 和四 41 两种特异性糖蛋白，前者为外膜糖蛋白，后者为跨膜糖蛋白(图 2-1)。 (二)结构基因HIV 基因全长约 9.8kb，含有 gag、pol、env3 个结构基因、2 个调节基因和 4 个辅助基因，分别称为tat(反式激活因子)、rev(毒粒蛋白表达调节子)；ncf(负调控因子)、vpr(病毒 r 蛋白)、vpu(病毒 u 蛋白)和 Vif(毒粒感染性因子)。HIV-1 的基因结构见图 2-2。
5、(三)临床意义HIV 的结构成分与病毒感染、临床诊断、药物、试剂和疫苗的研究密切相关。如包膜糖蛋白是病毒进入细胞的门户，针对各种病毒抗原(gp120、gp41、gp24 等)而产生的抗体是临床诊断的重要物质基础。三、艾滋病病毒在外界环境中生存能力HIV 一旦离开宿主在外界环境中生存能力便很快消失，HIV 对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙型肝炎病毒(HBV)的抵抗力低的多。因此，对 HBV 有效的消毒和灭活方法均适用于 HIV。(一)HIV 对温度的抵抗力HIV 对热很敏感，对低温的耐受性强于高温。因此，可以用高温灭活 HIV，在低温条件下保存 HIV。1. HIV 灭活：美国 C
6、DC 证明干燥环境中的 HIV 活性在几小时内降低 90%99%。在室温(2227)液体环境下 HIV 可存活 15 天以上；经 56处理 30 分钟可使 HIV 在体外对人 T 淋巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清中的 HIV；血清中 HIV 经过 603 小时或 8030 分钟作用后不能检出感染性 HIV。目前，WHO 推荐的逆转录病毒灭活方法是 10020 分钟。2. HIV 保存：在-70条件下，不加保护剂冷冻，HIV 可丧失感染性。若在-70条件下保存于 35%山梨醇或 50%胎牛血清(FBS)中可存活 3 个月以上。在液氮中(-196)HIV 可存活数年以上。因此，毒种必须置于液
7、氮中方可长期保存。(二)HIV 对化学品的抵抗力1. HIV 耐碱不耐酸在 pH3.0 条件下 HIV 滴度在 10 分钟可下降 4 个对数级，而 pH 值高达 9.0 时，HIV 滴度下降甚微。2. HIV 对化学因素很敏感0.5%次氯酸钠或 70%酒精在室温中，只需 1 分钟即不能检出 RT酶活性0.2%次氯酸钠、0.1%家用漂白粉、0.1%戊二醛、0.5%NP40、0.5%多聚甲醇等5 分钟即可灭活 HIV30%酒精溶液 5 分钟可灭活 HIV20%酒精溶液 10 分钟可灭活 HIV0.08%氯化氨在 10 分钟内使 HIV 滴度降至检出水平以下0.1%羟丙酸 -丙醇(BpL)、1：10
8、00 甲醛、50% 乙醚、0.5%三硝基甲苯 X-100均可使 1(10410 7)感染剂量的制品中HIV 全部灭活去垢剂 NP40在制备病毒蛋白时常规使用，HIV 对其抵抗力很弱，HIV 接触 NP40 1 分钟内，其传染性降低8 个对数级 TCID50冷丙酮或甲醛及丙酮 标本经其固定，可使标本中 HIV 灭活吐温 20(2.5%) 对 HIV 无灭活作用3.紫外线或丁射线不能灭活 HIVHIV 对紫外线或 射线不敏感，紫外线或 射线不能灭活 HIV 病毒。第二节 艾滋病病毒在人体内的复制一、进入易感细胞的途径(一)易感细胞体外培养表明多种人类细胞对 HIV 易感，但感染范围因不同病毒株而不
9、同，见表 2-2。一般来说，CD4 +细胞可以使 HIV 复制达到最高滴度。(二)进入易感细胞的通道HIV 需借助于易感细胞表面的受体方可进入，包括第一受体(CD4，主要受体)和第二受体(辅助受体)。HIV 的外膜糖蛋白 gp120 首先与第一受体 CD4 分子结合，gp120 的多个 CD4 结合决定簇在结合时互相影响，使 gp120 与 CD4+结合时发生构象改变。然后 gp120 再与第二受体(趋化因子)结合，使 HIV 与 CD4+细胞进一步靠拢，gp120 构象进一步改变，并与 gp41(gp36)分离，暴露出的 gp41(gp36)插入 CD4+细胞膜中，最终导致 HIV 与宿主细
10、胞膜的融合，并释放病毒内容物到 CD4+细胞中。HIV 胞膜是体液抗体反应的主要靶位，胞膜糖蛋白 gp120 和 gp41 有很强的抗原性，与抗体中和作用有关，也是免疫疫苗研究的靶点之一。早期的研究表明 HIV 通过与宿主细胞表面的 CD4 分子结合感染细胞，20 世纪 90 年代后大量的研究证明HIV 感染细胞仅靠 CD4 是不够的。1996 年人们发现了 HIV 感染的辅助受体，即 HIV 与 CD4 分子结合后再通过辅助受体方可进入细胞。目前，已经发现的与 HIV 感染有关的辅助受体有 2 类，一类是 CC 型辅助受体，如 CCR1、CCR2b、CCR3、CCR5；另一类是 CXC 型，
11、如 CXCR4。辅助受体的发现为人们进一步从分子水平了解HIV 的发病机制打开了新的通道。至此，HIV 生物学特性的研究进入了分子时代。CCR5 是最主要的第二受体。第二受体基因在不同人种中遗传的突变率有明显差异，缺乏第二受体表达的个体似乎对 HIV-1 感染有一定的抵抗力。这就是为何有些人反复多次与 HIV-1 感染者发生性行为而未感染，或有些 HIV-1 感染者长达 15 年以上未出现临床症状，其中有一部分就是具有缺损的 CCR5，造成细胞表面 CCR5 分子减少，从而减低对 HIV-1 易感性。(三)病毒-细胞融合HIV-1 主要通过与宿主细胞膜直接融合进入细胞，而不是通过吞噬作用。HI
12、V-1 作用于培养的细胞、无细胞融合现象的毒株称为 NSI 型(non-syncytium inducing)；引起细胞融合的毒株称为 SI 型(syn-cytium inducing)，表现为合胞体形成。一般 SI 型与 T 细胞嗜性有关，多见于艾滋病患者；NSI 型多见于 HIV 的早期感染者。(四)病毒进入缺乏 CD4 表达的细胞的机制没有 CD4 受体的人体细胞(脑、肠、阴道细胞)也可以感染 HIV。HIV 是通过这些细胞上半乳糖苷神经酰胺(GalC)受体来感染这些细胞的。这个受体是一种糖脂，可结合在病毒 gp120(V3 环)的不同区域，从而细胞被感染。此外，研究发现 HIV 还可能
13、通过如 MHC 相关分子、淋巴细胞的功能抗原 I 型(LFA-1)、Fc 和补体受体介导等其他机制进入细胞。二、HIV 在易感细胞内的复制(一)吸附及穿入HIV-1 感染人体后，病毒选择性的吸附于靶细胞的 CD4 受体上，病毒包膜发生构象改变，外膜糖蛋白gp120 的 V3 区与宿主细胞的 CCR5 或 CXCR4 结合，引起跨膜糖蛋白 gp41 区段与靶细胞膜上的融合结构域发生融合，使病毒核衣壳穿入宿主细胞。(二)脱衣壳和逆转录病毒进入细胞后包裹在病毒衣壳内的病毒 RNA，在与亲环素结合的衣壳蛋白 p24 的辅助下出胞。这一过程对环胞菌素 A 敏感。紧接着病毒 RNA 利用自身逆转酶的 RN
14、A 依赖的 DNA 聚合酶和 RNA 酶活性进行逆转录，最后合成病毒基因组的双链 DNA 分子(cDNA)。(三)环化cDNA 在环化酶的作用下形成以共价或非共价结合的双链环状 DNA 分子。其中非共价结合的环状 DNA 是整合到宿主染色体上的形式，抗病毒药对此无效。大多数新合成的病毒 DNA 以游离、非整合的共价结合的环状 DNA 形式保留在细胞浆内，它没有转录作用，但有致病理变化作用，抗病毒药对以这种形式存在的病毒有效，可使病毒载量下降。(四)整合在整合酶的作用下，新形成的非共价结合的双股 DNA 整合人宿主细胞染色体 DNA 中。这种整合的病毒双股 DNA 即前病毒。这样感染就持续存在。
15、前病毒 DNA 存在于宿主细胞 DNA 中，一般没有病毒蛋白的合成，成为潜伏状态，也可以免受宿主免疫系统的攻击。(五)转录当前病毒被活化而进行自身转录时，病毒 DNA 在转录酶的作用下形成 RNA，一些 RNA 经拼接而成为病毒mRNA；另一些 RNA 经加帽加尾成为病毒的子代基因组 RNA。(六)翻译与装配病毒利用宿主细胞内的核蛋白体，依据 mRNA 上各个基因组的遗传信息翻译出所需要的各种病毒蛋白，再在内质网核糖体进行糖化和加工，在蛋白酶作用下裂解，产生子代病毒的蛋白和酶类。Gag 蛋白与病毒RNA 结合装配成核壳体。 (七)病毒体成熟、出芽病毒颗粒通过芽生方式从胞浆膜释放时获得病毒体的包
16、膜。抗病毒治疗可以直接针对病毒复制的每一个步骤，从而可以中断病毒的复制和传播。三、病毒生物学特征对病程的影响艾滋病病毒感染过程中，不同个体 CD4，细胞数的下降速率相差很大，从稳定的长期不进展状态(病程大于 10 年)到数年内发展为艾滋病。大量的研究表明病毒与宿主之间的相互作用是决定病程进展的关键因素。自 1989 年成功地从 HIV 感染者体内分离出 HIV 以来，人们在实验室对它的复制特性进行了大量的研究，发现从处于不同病程阶段感染者血中分离的原代病毒株的复制速率和原代培养中所获得的病毒量是不同的，提示病毒学因素对于决定病程进展可能是至关重要的，也就促使人们进一步调查和研究 HIV 的生物
17、学特性，如复制速率、致细胞病变特性以及病毒在细胞培养中的嗜性。研究发现，不仅在不同感染者其病毒的生物学特性不同，病程进展速率不同，SI 型病毒感染的个体病程进展较 NSI 型感染者快。即使在同一个体病程进展过程中，其病毒的生物学特性也会有所改变，可由病程早期的 NSI 型转变为晚期的 SI 型。正如 HIV 的基因会时常发生变异一样，病毒对辅助受体的利用也在不断的变化中，研究表明在病程的早期 HIV 进入细胞所利用的受体是 R5 受体，随着病程的进展、宿主细胞识别 HIV 能力的增强和 HIV 自身为在宿主细胞内播散及更不受阻的进入细胞而会出现受体利用转移，如利用RSX4 或 R3RSX4 受
18、体。这些变化的物质基础是基因的变异，结果尚不明确但可以想象的是 HIV 在体内不被清除反而毒性加强，药物受体抑制剂的作用不显著。第三节 艾滋病病毒感染导致的人体变化及最终结局一、HIV 感染导致的人体变化 人体感染 HIV 后，即开始了病毒试图在体内生存，机体免疫反应试图清除病毒的两种力量的持续较量。在没有任何有效治疗的情况下，数年或十数年后病毒将战胜机体，病人死亡。(一)病毒在体内的复制HIV 在人体内的半衰期为 2 天，每天产生或清除的病毒量平均约为 109。病毒在体内快速复制、播散、破坏细胞，最终战胜免疫系统的抵抗，使机体衰竭。按照病毒复制过程和各个阶段的主要特征将病毒在体内的动态分为以
19、下几个期：1.体内播散期病毒进人体内在 2 天内到达局部淋巴结，5 天内进入血液循环。其结果是导致全身性播散，到达脑部和淋巴组织。2.原发 HIV 感染期从暴露于 HIV 到出现症状的时间一般是 24 周，但是在少数病例可长达 10 个月。在急性感染的数天内，淋巴结内被激活的淋巴细胞中出现高水平的病毒复制，在很短的几天内出现 P24 抗原血症和高滴度病毒血症，每毫升血浆中可检出 107个病毒 RNA 分子。CD8+细胞计数上升，并伴有短暂的 CD4、细胞计数下降。随着特异性体液免疫应答的出现，病毒血症减轻，突变病毒出现，病毒成为异质群体。免疫应答出现后，血浆中 HIVRNA 的滴度会下降 23
20、 个对数级，急性 HIV 感染的症状也会消失。3.血清转换期用标准第三代 EIA 试剂检测，通常 3 周发生 HIV 抗体阳转。从 HIV 感染到产生抗体(或血清抗体阳转)称为“窗口期”，95%的 HIV 抗体都发生在感染后的 5.8 个月，故一般认为窗口期为 6 个月。“HIV 感染早期”的定义为血清抗体阳转和 HIV 感染 6 个月之间的阶段。6 个月时病毒载量达到一个“固定值”，如果不进行抗病毒治疗，几年内不会有很大变化。这个固定值和预后有很大关系。早期治疗的目标之一是重新设定固定值，使固定值保持较低水平。临床上的急性感染期包括了 HIV 在体内的这三个阶段，回顾性的调查发现非典型的症状
21、如：发热、疲乏、咽炎、头痛、腹泻、口腔、食管或生殖器黏膜溃疡、关节痛等会出现。4.无症状感染期这个时期病人无临床症状，体检时无异常，少数可查到“持续性全身性淋巴腺病”(PGL)，定义为肿大的淋巴结至少发生在两处且不是腹股沟淋巴结。这个时期由于细胞外的病毒被 滤泡树突状细胞(FDC)捕捉而进人生发中心，细胞内的病毒大部分处于潜伏状态，所以淋巴结中病毒浓度很高。这个时期淋巴组织是病毒的主要藏身处，外周血中的病毒载量相对不高，随着疾病的进程，淋巴结结构被破坏，更多的病毒释放出来。此期相当于临床病程的潜伏期，上述的不典型症状很快消失，患者无临床症状出现。5.艾滋病前期(“ARC”或“B 期”)B 期症
22、状包括被 HIV 感染后更常见更严重的症状，但还不是艾滋病的典型症状。此期也即临床的艾滋病相关综合征期，症状包括被 HIV 感染后更常见、更严重的症状，但还不是艾滋病的典型症状。常见并发症包括鹅口疮、口腔毛状黏膜白斑病、末梢神经紊乱、子宫颈上皮肿瘤、全身性症状(发热、体重减轻)、复发性带状疱疹、特发性血小板减少性紫癜和李斯特菌病。6.艾滋病期当患者出现典型症状时，CD4 +细胞计数通常降至 200 个/l 以下，血和淋巴结中的病毒载量又上升到相当高的水平，同时抗病毒 CD8+细胞反应减弱。在艾滋病期病人血液中的 HIV 群体又一次变得相当均一，通常是细胞融合(SI)表型为主，与 T 细胞嗜性有
23、关。7.艾滋病晚期这个时期指 CD4+计数50 个/l 的病人，若不经治疗平均存活期是 1218 个月。此即真正意义上的艾滋病(AIDS)期，此期一系列的指征性疾病会在不同的患者身上出现，包括：浸润性宫颈癌、食道、气管、支气管或肺念珠菌病、弥漫性或肺外球孢子菌病、肺外隐球菌病、HIV 相关痴呆症、伯基特淋巴瘤、HIV 相关的消瘦等等，最后的结局是患者死于并发症。 在这些不同的临床阶段，病毒群依次经历均一性到异质性，又恢复到均一性等特征。晚期病毒以 SI 表型为主的特征与在宿主中的毒力有关。二、HIV 感染的三种临床结局(一)典型进展者在感染早期，其免疫功能未受损害，但在 810 年内免疫控制能
24、力逐渐下降，最后发展成为艾滋病。(二)快速进展者这个群体的 CD4+细胞计数在 25 年内迅速下降，抗 HIV 的抗体水平很低，而且该抗体中和 HIV 的能力也较差，也可能有增强抗体。快速进展者中最显著的特征是 HIV 感染后一直维持较高的病毒载量，而且分离的 HIV 有均一性。(三)长期存活者(又称长期不进展者)这些感染者能维持健康状态 12 年以上，并且 CD4+细胞计数维持正常。这些长期存活者在所有感染者中的比例一般在 8%10%，目前最长已达 17 年。这些无症状者可在血友病患者、静脉吸毒者、异性接触者和新生儿中发现。长期存活者常常具有如下特征：病毒载量低(血浆和 PBMC)、HIV
25、毒株是相对非致病性毒株、针对个体中现存 HIV 毒株的抗体不会加重感染、PBMC 产生 I 型细胞因子、CD8 +细胞抗病毒反应很强。三、能否从体内彻底清除艾滋病病毒HIV 整合至宿主细胞染色体及其高度变异特性为其在宿主体内长期生存奠定了基础。HIV 一旦感染即整合到宿主细胞染色体上，除非破坏细胞，否则无法清除细胞内的病毒。同时，由于 HIV 具有高度变异性，对感染者个体来说，同一感染者在感染的不同阶段、不同组织器官在疾病的同一阶段分离到的毒株核苷酸序列均会有一定差异；对病毒本身而言，这种高度变异性可导致病毒表型的改变，从而改变宿主疾病过程和临床症状，产生耐药株使治疗药物失效，或对疫苗产生逃逸
26、免疫控制使疫苗无效，最终致使 HIV 长期在体内存活。此外，在某些静止细胞内，HIV-1 的复制中止在逆转录阶段，从而产生一个不稳定的、未能完全复制的中间型。最新的研究发现，无症状 HIV-1 感染者体内 CD4+淋巴细胞主要含有大量未整合的 HIV-1 DNA，而艾滋病人主要带有整合的 HIV-1 DNA。未整合的 HIV-1DNA 保持其整合能力，在受到细胞内因子激活后，HIV-1 DNA 可整合人细胞 DNA。目前的治疗药物对于静止细胞内病毒复制不显示抑制作用。因此，静止细胞作为体内 HIV-1 来源的储藏库，使其长期存活在体内。这些都使彻底清除体内的病毒变得十分困难。然而仔细分析一下病毒感染后的过程可以发现彻底清除病毒并不是一点希望也没有。HIV 感染宿主免疫细胞后以每天产生 10910 10病毒颗粒的高速度进行复制，但是如果宿主免疫功能完整，每天被清除的 HIV颗粒约为 10710 9，也就是说每天约有 99%以上的病毒颗粒能够被宿主免疫系统清除，人体若能保持这种强大的清除能力，至少可以维持病毒复制与免疫清除的动态平衡。目前，我们还不清楚为何这种动态平衡会随着病程的进展而消失，人们正在努力探索和寻找维持或恢复机体免疫功能的途径与方法，如促使静止细胞内病毒复制然后进行抗病毒治疗。已经有资料显示有可能清除静止细胞内的 HIV。
