1、PCR聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术.它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一 DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研 究和检测鉴定.过去几天几星期才能做到的事情,用 PCR 几小时便可完成.PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑.PCR 在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断.癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤
2、早期和良性的阶段就可出现.PCR 技术不但能有效的检测基因的突变,而且能准确检测癌基因的表达量, 可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断.PCR 技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和 -地中海贫血的基因突变开始的.基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡,用 FQ-PCR 检测各种珠蛋白基因表达差异,是地中海贫血诊断的有效手段.PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的 天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板DNA 经加 热至 93左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形
3、成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合, 为下轮反应作准备；模板 DNA 与引 物的退火( 复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55左右, 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合 物在 TaqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 为反应原料, 靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理 ,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需 4 分钟 ,3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.到达平台期(Pl
4、ateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝 .PCR 的应用在基因诊断和肿瘤标志物检测两大领域.关于名称根据 MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）的指导方针，qPCR 为 Quantitative real-time PCR 的简称，RT-qPCR指的是 Reverse transcriptionqPCR，RT-PCR 仅用来表示 Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是 Real-time PCR，
5、但是有少数作者并没有坚持这一原则。根据所使用的技术不同，实时荧光定量 PCR 可以分为：荧光探针和荧光染料两种方法。现将其原理简述如下：1. TaqMan 荧光探针：TaqMan 探针法是高度特异的定量 PCR 技术，其核心是利用 Taq酶的 35 外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 35外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每
6、扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2. SYBR 荧光染料 ：在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料非特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。SYBR 仅与双链 DNA 进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定 PCR 反应是否特异。SYBR 荧光染料法定
7、量 PCR 的基本过程是：1 开始反应，当 SYBR 染料与 DNA 双链结合时发出荧光；2 DNA 变性时，SYBR 染料 释放出来，荧光急剧减少；3 在聚合延伸过程中，引物退火并形成 PCR 引物；4 聚合完成后，SYBR 染料与双链产物结合，定量 PCR 系统检测到荧光的净增量加大。实时荧光定量 PCR 技术根据化学原理可以分为探针类和非探针类。探针类实时荧光定量 PCR 技术主要是利用与靶序列特异杂 交的探针来指示扩增产物的增加；非探针类实时荧光定量 PCR 技 术主要通过荧光染料来指示产物的增加。无论是探针类实时荧光 定量 PCR 技术还是非探针类实时荧光定量 PCR 技术，检测的都
8、是 扩增产物的增加量。但探针类实时荧光定量 PCR 技术增加了识别 探针的具体的流程，操作的难度较大。实时荧光定量 PCR 技术的特点1 准确性高 实时荧光定量 PCR 技术使用专门针对靶序 列设计的特异性来识别定量分子，准确度很高，由靶序列和探针 双方面控制，大大提升了 PCR 技术的特异性，降低了检测的假阳 性率。2 灵敏度高 实时荧光定量 PCR 技术将传统的 PCR 技 术、荧光标记技术和激光技术进行了融合，提高了检测的灵敏性。3 线性反映好 由于荧光信号和扩增产物具有一定的联 系，因此，使用实时荧光定量 PCR 技术可通过检测荧光信号定量 扩增产物。4 易操作、环保性高 使用实时荧光定量 PCR 技术进行 检测是在一个管内完成的，可减少相关污染物的排放，检测可在 一次完成，无需进行反复的检测，不会出现反复污染的情况。5 速度快、效率高 使用实时荧光定量 PCR 技术可在 2 3 个小时完成多个样品的定量分析，有效地减少医务工作者 的劳动量。
